本發(fā)明公開(kāi)了一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶及方法和應(yīng)用。采用技術(shù)方案是：從小麥幼葉中提取小麥總RNA，經(jīng)RT-PCR獲取wPDI基因。將目的基因連接到載體PET-30b中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)重組大腸桿菌，離心收集菌體細(xì)胞；用超聲法破碎菌體細(xì)胞后，離心后收集上清液；經(jīng)一次Ni-sepharose親和層析，獲得wPDI。本發(fā)明通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了wPDI大量表達(dá)和簡(jiǎn)便的純化工藝；獲得的wPDI在面粉的加工品質(zhì)實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的改善小麥加工品質(zhì)的作用，可用于面粉加工中。

1.利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的方法，其
特征在于，包括如下步驟：
(1)從小麥幼葉中提取小麥總RNA，通過(guò)RT-PCR獲取小麥蛋白質(zhì)二硫鍵
異構(gòu)酶基因，將此基因連接到PMD-19T載體上，從T載體上克隆的目的基因
經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒PET-30b中，酶切位點(diǎn)分別為BamH?I和Xho?I，
構(gòu)建出表達(dá)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒PET30b-wPDI；
(2)將質(zhì)粒PET30b-wPDI轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大
腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD值達(dá)
到0.6-0.8時(shí)，在16-22℃的低溫條件下用0.5mM?IPTG誘導(dǎo)6-7小時(shí)后，4℃
離心收集菌體細(xì)胞；
(3)用超聲破碎法冰浴裂解細(xì)胞，除去不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；將
上清液過(guò)Ni-sepharose親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫得到帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)
二硫鍵異構(gòu)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)將目的基因插入
到PET-30b所用的引物序列為5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，
5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，
所述RT-PCR中所用引物序列為：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’,
5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述超
聲破碎法冰浴裂解細(xì)胞的條件為：振幅20％，0.4s一次，每5min停止一次，
共進(jìn)行兩次，10000rpm，4℃離心15min。