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一種高效合成α-氨基丁酸的單細胞工廠及其構建與應用

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2022-01-07
  • 技術成熟度:已有樣品
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201611006643.2 
  • 技術(專利)名稱 一種高效合成α-氨基丁酸的單細胞工廠及其構建與應用 
  • 項目單位 江南大學
  • 發明人 饒志明,周俊平,楊套偉,張顯,徐美娟,張蔡喆,戚云龍,鄭俊賢 
  • 行業類別 藥品-化學藥品
  • 技術成熟度 已有樣品
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 吳栩達
  • 發布時間 2022-01-07  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種高效合成α?氨基丁酸的單細胞工廠及其構建與應用,屬于微生物技術領域。本發明將L?蘇氨酸脫氨酶、L?氨基酸脫氫酶及提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因串聯表達構建重組的大腸桿菌單細胞工廠用于α?氨基丁酸高效合成,通過rbs序列優化控制L?蘇氨酸脫氨酶的表達量,解決中間產物酮丁酸的快速積累而抑制轉化的問題,同時通過啟動子及rbs序列優化控制提供輔因子NADH循環的脫氫酶表達量,增強NADH再生速率最終增加產量。利用單細胞工廠進行全細胞轉化可減少物質進出障礙加快轉化速率,促進輔因子胞內循環而無需外源添加,成本低廉。在20h內,5L發酵罐中重組大腸桿菌單細胞工廠產量為204g/L,時空產率10.2g/L·h,為其工業化生產提供實際有效策略。
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  • 02

    說明書

    1.一種高效合成α-氨基丁酸的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述重組菌單細胞工廠是將重組共表達載體轉化到宿主菌中得到的;所述重組共表達載體是在質粒載體上串聯L-蘇氨酸脫氨酶基因、L-氨基酸脫氫酶基因、提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因;其中,以L-氨基酸脫氫酶基因的表達為基準,控制供輔因子NADH循環的脫氫酶的表達量使輔因子NADH的生成速率處于相對較高的水平,控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量處于相對較合適的水平,所述宿主為大腸桿菌;所述L-蘇氨酸脫氨酶基因前的啟動子為T7啟動子;L-蘇氨酸脫氨酶基因前直接連接的rbs序列為序列SEQ ID NO:4~SEQ ID NO:6所示序列中的任意一種;所述L-蘇氨酸脫氨酶基因和L-氨基酸脫氫酶基因通過序列為SEQ ID NO:22所示序列的RBS連接,所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前的啟動子為tac啟動子,輔因子NADH循環的脫氫酶基因前的rbs序列為SEQ ID NO:37~SEQ ID NO:39中的任意一種。2.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述的重組菌單細胞工廠能得到較優的從L-蘇氨酸到中間產物酮丁酸及從酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率,不會造成中間產物酮丁酸的積累因而不會造成對反應的抑制;同時所述的重組菌單細胞工廠不需要外源添加輔因子,相比于其他方法減少了底物進出細胞或擴散的路徑從而增加了轉化速率。3.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述重組菌單細胞工廠的構建方法,包括:(1)根據啟動子及L-蘇氨酸脫氨酶的基因序列,設計不同強度的rbs序列用來控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量從而控制L-蘇氨酸到酮丁酸的轉化速率;(2)對輔因子NADH的供應速率進行了調控,是對啟動子以及rbs序列進行優化來控制提供輔因子NADH循環的脫氫酶表達量從而控制輔因子NADH的再生速率;(3)將rbs優化后的L-蘇氨酸脫氨酶基因、L-氨基酸脫氫酶基因、啟動子以及rbs優化后的提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因按順序連接,構建重組共表達載體,并將重組共表達載體轉化宿主菌中,構建基因工程菌單細胞工廠。4.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述L-蘇氨酸脫氨酶基因前有質粒載體自身攜帶的啟動子、針對L-蘇氨酸脫氨酶基因和質粒載體設計的表達強度低于質粒載體本身rbs的rbs序列;所述L-蘇氨酸脫氨酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因之間通過質粒載體自身攜帶的rbs連接;所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前有針對提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因和質粒載體設計的啟動子、表達強度高于或等于質粒載體本身rbs的rbs序列。5.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述質粒載體是任意一種可商業化購買的質粒載體,或者是任意一種已有報道的經改造的質粒載體。6.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述L-蘇氨酸脫氨酶選自但不限于大腸桿菌來源的L-蘇氨酸脫氨酶。7.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述L-氨基酸脫氫酶選自:但不限于,芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶、紅球菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶。8.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶選自:但不限于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶、枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶、惡臭假單胞桿菌的葡萄糖脫氫酶。9.根據權利要求1所述的重組菌單細胞工廠,其特征在于,輔因子NADH循環的脫氫酶基因前的rbs序列為SEQ ID NO:37的序列。10.一種發酵合成α-氨基丁酸的方法,是利用權利要求1~9任一所述的重組菌單細胞工廠。11.權利要求1~9任一所述的重組菌單細胞工廠應用于α-氨基丁酸、酮丁酸或其相關附屬產物的合成。
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