1.一種禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗的制備方法，其特征在于：步驟一、引物設計根據禽霍亂菌基因組序列設計用于擴增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物P1和P2：P1：5’-GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3’；P2：5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’；步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴增及純化1）在0.2ml的PCR反應管中加入引物P1和引物P2各1μl，再依次加入DNA聚合酶0.5μl、聚合酶緩沖液2.5μl、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μl、禽巴氏桿菌的基因組1μl和水16μl，再將含有上述試劑的PCR反應管放入PCR擴增儀中，進行PCR反應，PCR反應程序：首先進行94oC預變性，時間為5分鐘，預變性結束后進入循環過程，每個循環的程序為：94oC變性，時間為1分鐘，57oC復性，時間為45秒鐘，72oC延伸，時間為1分鐘，將上述循環程序重復30次，30次循環結束后，72oC再次延伸，時間10分鐘，得到PCR擴增的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物，備用；2）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物，在凝膠成像系統中觀察到目的基因后，備用；3）按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作：取1.5ml的離心管a并稱其重量，然后在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物切下來，將切下來的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物放在已稱重的1.5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重并計算出從凝膠上切下來的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物的重量，然后將離心管a中的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物搗碎，加入等體積的溶液Ⅰ，混合均勻止，將離心管a放置在50oC水浴中加熱至離心管a中的物質完全融解止，將融解后的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a中，在21oC條件下放置1分鐘，后將收集管a放在離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，再向收集管a內的DNA純化柱a中加入700μl的溶液Ⅱ，在21oC條件下放置1分鐘，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，后向DNA純化柱a上加入500μl的溶液Ⅱ，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，將收集管a在轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a置于1.5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μl溶液Ⅲ，將離心管b在21oC條件下放置1分鐘，將離心管b在轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘，棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μl液體，該液體就是純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因；步驟三、真核表達載體pcDNA3.1+的酶切及純化：1）酶切體系的配制：在1.5ml的離心管c中加入真核表達載體pcDNA3.1+?10μl、限制性內切酶KpnⅠ3μl、限制性內切酶EcoRⅠ3μl、限制性內切酶緩沖液5μl和水29μl，混合均勻止，得到的混合物A，將上述混合物A放入37oC的水浴鍋中反應8小時，備用；2）利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物A，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；3）按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作：取1.5ml的離心管d并稱其重量，在紫外燈下將凝膠上的混合物A切下來，將切下來的混合物A放在已稱重的1.5ml的離心管d中，稱取離心管d的總重并計算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將離心管d中的混合物A搗碎，加入等體積的溶液Ⅰ，混合均勻止，將離心管d放置在50oC水浴中加熱至混合物A完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管b在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入500μl的溶液Ⅱ，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內的液體，倒掉收集管b中的液體后將放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1.5ml的離心管e中，后在DNA純化柱b上加入40μl溶液Ⅲ，將離心管e在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達載體pcDNA3.1+，備用；步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的制備：1）在1.5ml的離心管f中依次加入純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μl、限制性內切酶KpnⅠ3μl、限制性內切酶EcoRⅠ3μl、限制性內切酶緩沖液5μl和水24μl，混合均勻止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37oC的水浴鍋中反應5小時，取出備用；2）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；3）按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作：取1.5ml的離心管g并稱其重量，在紫外燈下將凝膠的混合物B切下來，將切下來的混合物B放在已稱重的1.5ml的離心管g中，稱取離心管g的總重并計算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然后將離心管g中的混合物B搗碎，加入等體積的溶液Ⅰ，混合均勻止，將離心管g放置在50oC水浴中加熱至混合物B完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位于收集管c中，收集管c在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內的液體，離心后倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管c在21℃條件下將放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入500μl的溶液Ⅱ，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內的液體，倒掉收集管c中的液體后將放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c并放置于1.5ml的離心管h中，后在DNA純化柱c上加入40μl溶液Ⅲ，將離心管h在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中的40μl液體，該液體就是酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；4）在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μl、酶切并純化后的真核表達載體pcDNA3.1+2μl、DNA連接酶1μl、DNA連接酶緩沖液2μl和水5μl，混合均勻止，將離心管i放入16oC的水浴鍋中，反應12小時，備用；5）待反應結束后，在離心管i中加入200μl的大腸桿菌JM83，先將離心管i置于0oC的冰水混合物中，時間30分鐘，取出置于42oC條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置于0oC的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管i中加入0.5ml的LB液體培養基，形成含有LB液體培養基的混合液，備用；6）將離心管i置于37oC的搖床中振蕩培養，轉速200轉/分鐘，時間為1.5小時，結束后，取100μl含LB液體培養基的混合液涂布于含濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB培養固體培養基上，將涂布后的LB培養固體培養基置于37oC的培養箱內，倒置培養16小時，備用；7）挑取培養后的LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入5ml含氨芐青霉素的的LB液體培養基中，其氨芐青霉素的濃度為50μg/ml，后將含氨芐青霉素的LB液體培養基置于37oC恒溫搖床內，在轉速為200轉/分鐘，振蕩培養16小時；8）待振蕩培養結束后，取1ml含有菌落的LB液體培養液加到1.5ml的離心管j中，將離心管j放入離心機內離心，轉速12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄清液體，加入100μl的預先冷卻至4oC的溶液Ⅳ，均勻混合后，加入200μl的溶液Ⅴ，混合均勻止，后將離心管j置于0oC的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管j中加入150μl的預先冷卻至4oC的溶液Ⅵ，混合均勻，后將離心管j放于0oC的冰水混合物中，靜置5分鐘，取出放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4oC的條件下離心10分鐘，后取出，備用；9）取離心管j中的上層澄清液體400μl，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中加入苯酚200μl和氯仿200μl，振蕩混勻后，放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，待離心結束后取上層液體400μl移入到1.5ml的離心管m中，加入800μl的無水乙醇，將離心管m于-20oC條件下，放置20分鐘，后取出放入冷凍離心機內，轉速13000?轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；10）在離心管m中加入濃度為70％的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4oC條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉淀物Ⅰ，該沉淀物Ⅰ為pCA質粒，待pCA質粒干燥后，加入30μl超純水進行溶解，得到的溶液為pCA質粒溶液；11）在1.5ml的離心管n中，加入2μl的pCA質粒溶液，后依次向離心管n中加入1μl的限制性內切酶KpnⅠ、1μl的限制性內切酶EcoRⅠ、1μl的限制性內切酶緩沖液和水5μl，混合均勻后，置于37oC條件下，反應2小時，形成酶切液；12）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測pCA質粒酶，在凝膠成像系統中進行觀察，觀察到1050bp大小的條帶，pCA質粒是本發明制備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質粒的大量制備：1）挑取步驟四中含有pCA質粒的大腸桿菌JM83；2）挑取培養后LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入25ml含氨芐青霉素的的LB液體培養基中，其氨芐青霉素的濃度為50μg/ml，后將LB液體培養基，置于37oC恒溫搖床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，至液體在600納米處的吸光度，OD600值為0.6止，將振蕩培養后的液體轉至500ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，其氨芐青霉素的濃度為50μg/ml，置于37oC恒溫搖床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，培養15小時；3）待振蕩培養結束后，將含有菌落的500ml?LB液體培養基放入1000ml的離心管中，將1000ml的離心管放入冷凍離心機內，轉速6000轉/分鐘，4oC條件下離心時間15分鐘，棄去上層澄清液體得到沉淀物Ⅱ，向離心管中加入18ml的預先冷卻至4oC的溶液Ⅳ，將沉淀物Ⅱ懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液Ⅴ，混合均勻止，將1000ml的離心管置于20oC條件下，放置5分鐘，后向1000ml的離心管中加入20ml?預先冷卻至4oC的溶液Ⅵ，混合均勻，將其放于0oC的冰水混合物中，靜置10分鐘，?取出放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4oC條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備用；4）在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇，振蕩混勻后在20oC條件下放置10分鐘，后放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4oC的條件下離心20分鐘，待離心結束后倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉淀物Ⅲ，再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機內，轉速12000?轉/分鐘，4oC的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉淀物Ⅲ干燥后備用；5）在含有沉淀物Ⅲ的200ml離心管中加入3ml的pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物Ⅲ溶解，將溶解后的溶液轉移至15ml的離心管中，在0oC的冰水混合物中，放置10分鐘，后向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶液，放入冷凍離心機內，轉速10000轉/分鐘，離心時間10分鐘，取上層澄清液體，備用；6）在10ml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放于20oC條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機內，轉速12000?轉/分鐘，4oC的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物Ⅳ，干燥，備用；7）向含有沉淀物Ⅳ的10ml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，將沉淀物Ⅳ溶解，后向溶液中加入0.25ml的苯酚和0.25ml的氯仿，至混合均勻止，將10ml的離心管放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4oC的條件下離心10分鐘，取0.5ml的上層澄清液體轉至5ml的離心管內，加入1ml的無水乙醇，置于-20oC條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機內，轉速13000?轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉淀物Ⅴ，干燥備用；8）向含有沉淀物Ⅴ的5ml離心管中加入1ml超純水，使沉淀物Ⅴ溶解，加入0.5ml的聚乙二醇-氯化鎂，PEG-MgCl2溶液，置于20oC條件下，放置30分鐘，放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0.5ml濃度為70%的乙醇，放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物Ⅵ，該沉淀物就是大量制備的pCA質粒即為制備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；9）向含有沉淀物Ⅵ的5ml離心管中加入1ml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，使沉淀物Ⅵ溶解，溶解后的溶液為大量制備的pCA質粒溶液，后用分光光度計測定溶液中所含的pCA質粒的濃度，備用；10）對禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在凝膠成像系統中觀察到條帶為1050bp時，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗制備成功；所述的載體為真核表達載體pcDNA3.1+；所述的LB培養固體培養基的組成成分為按重量比每升LB培養固體培養基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1.5%的瓊脂粉和水；所述的LB液體培養基的組成成分為按重量比每升LB液體培養基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述的溶液Ⅰ的組成成分為按質量比每升溶液Ⅰ中含有50?mmol/L的葡萄糖、25?mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10?mmol/L的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的溶液Ⅱ的組成成分為按重量比每升溶液Ⅱ中含有10mmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的溶液Ⅲ的組成成分為按重量比每升溶液Ⅲ中含有60%的5?mol/L的乙酸鉀、11.5%的冰醋酸，余量為水；所述的磷酸鹽緩沖液的組成成分為按重量比每升磷酸鹽緩沖液中含有0.8%的氯化鈉、0.02%的磷酸二氫鉀、0.02%的氯化鉀、0.29%的十二水合磷酸氫二鈉，余量為水。
展開
