1.一種基于人源骨架蛋白Fn3制備腦鈉肽前體抗原替代物的方法,其特征在于,包括以
下步驟:
1)、骨架蛋白Fn3展示NT-proBNP線性表位重組蛋白表達載體構建:
(1)根據Fn3骨架蛋白晶體結構,設計展示表位位置,根據模建結果,將NT-proBNP線性
表位設計在Fn3骨架蛋白的FG區,將能與抗腦鈉肽前體抗體結合的抗原表位核苷酸序列置
換骨架蛋白Fn3的編碼FG區的核苷酸序列,構成骨架蛋白Fn3與NT-proBNP線性表位融合基
因,合成Fn3展示NT-proBNP線性表位的基因片段,在融合基因下游融合編碼6個組氨酸的分
離純化標簽(His-tag),便于分離純化:采用人纖維連接蛋白III型結構域(Fn3)蛋白為模式
基因,在基因的5′末端引入編碼6個組氨酸殘基,在FG loop區引入NT-proBNP編碼表位的核
苷酸序列CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT,以上設計合成的基因編碼Fn3展示NT-proBNP
線性表位重組蛋白, 命名為Fn3-epitope;
(2)將以上融合基因構建到大腸桿菌胞內表達載體上,融合的重組蛋白將在大腸桿菌
胞內表達:將上述設計合成的基因,用Nco I和Hind III構建到大腸桿菌表達載體pET28a
(+)上,得到重組載體pET28-Fn3-epitope;
2)、將構建的重組蛋白基因質胞內表達載體轉化到大腸桿菌工程菌株,篩選得到陽性
克隆,此陽性克隆表達的重組蛋白就展示有線性抗原表位,將鑒定過的陽性轉化子進行自
誘導表達,誘導表達3-6小時,培養基中添加與表達載體所帶抗性基因相應的抗生素;
將構建的表達載體電擊轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3),然后將轉化子接種到10毫升含
有Kan的LB培養基中,過夜培養,次日,以1:100接種到500毫升含有Kan的LB培養基的2升三
角瓶中,200rpm、37℃培養,直至OD600達到0.6,然后,在25-35℃、200rpm條件下添加1毫摩爾
的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達3小時,在此過程,在大腸桿菌胞內表達重組蛋
白;
其中,Kan的濃度為每毫升LB培養基中含50微克卡那霉素;LB培養基的配方為: 胰蛋白
胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化鈉(NaCl)10g/L;
3)、收集菌體,提取可溶蛋白,用親和層析方法,分離純化重組蛋白,該蛋白即為包含有
線性抗原表位的融合蛋白:用鎳柱純化His-Tag的重組蛋白,得到純化的重組蛋白Fn3-
epitope。
2.根據權利要求1所述的一種基于人源骨架蛋白Fn3制備腦鈉肽前體抗原替代物的方
法,其特征在于,所述的純化的重組蛋白Fn3-epitope可展示腦鈉肽前體抗原表位,能夠作
為相應抗原的替代物。
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