本發明提供了一種青霉素G酰化酶的突變體及其制備方法和應用。通過非理性及半理性設計的酶工程改造技術對大腸埃希氏菌ATCC 11105來源的青霉素G?；高M行突變，獲得了一種反應活性更高，反應速率更快，轉化率更好，青霉素G濃度耐受性更強，底物殘留更少，苯乙酸濃度耐受性更高的PGA突變體，同時對該突變體進行了重組表達、菌種構建、發酵培養以及固定化和應用制備6?APA。本發明獲得的PGA?6突變體活力提高了102倍，底物青霉素G耐受濃度提高到30％，苯乙酸耐受濃度提高到20mmol/L。同時，固定化突變體PGA?6應用于pH8.0，25℃條件下裂解25％濃度的青霉素G制備6?APA的反應時間縮短到55分鐘，底物轉化率在98％以上，且連續使用600批次以上，活力無明顯的損失，具有很好的操作穩定性。

1.一種青霉素G酰化酶突變體，其特征在于，其在SEQ ID NO.2的埃希氏大腸桿菌
ATCC11105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A上，有如下任意一種情況的突變：
(1)第748位氨基酸由D突變為V；
(2)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S；
(3)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變為
F；
(4)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第206位氨基酸由N突變為
Q；
(5)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第206位氨基酸由N突變為
K；
(6)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變為
F，第206位氨基酸由N突變為D；
(7)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變為
F，第206位氨基酸由N突變為D，第602位氨基酸由T突變為D；
(8)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變為
F，第206位氨基酸由N突變為D，第506位氨基酸由N突變為D；
(9)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變為
F，第206位氨基酸由N突變為D，第602位氨基酸由T突變為G；
(10)第748位氨基酸由D突變為V，第209位氨基酸由T突變為S，第179位氨基酸由L突變
為F，第206位氨基酸由N突變為D，第506位氨基酸由N突變為D，第602位氨基酸由T突變為Q。
2.一種青霉素G?；竿蛔凅w的核苷酸序列，其特征在于，為權利要求1所述的青霉素G
?；竿蛔凅w中的任一種的核苷酸序列；
3.權利要求1所述的青霉素G酰化酶的突變體的應用，其特征在于，用于將青霉素G水解
為6-APA和苯乙酸。
4.一種突變型青霉素G?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟冢ㄒ韵虏襟E：
a)將權利要求1所述的青霉素G酰化酶的突變體的基因序列插入到質粒中得到表達載
體；
b)將表達載體轉化進入菌株中得到重組基因工程菌；
c)將重組基因工程菌用乳糖誘導進行發酵得到青霉素G?；?。