本發(fā)明涉及親和層析法生產(chǎn)高純度糜蛋白酶的制備方法，該制備方法包括以下工藝步驟：(1)生產(chǎn)用直接原料：新鮮冷凍牛胰或豬胰；(2)原料粉碎、提取蛋白；(3)分級(jí)鹽析、酶原結(jié)晶；(4)粗品酶解；(5)親和層析分離純化；(6)超濾濃縮除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明已建立起一套規(guī)模化生產(chǎn)的生產(chǎn)工藝，體現(xiàn)出了親和層析法制備糜蛋白酶的高效性、專(zhuān)一性，有利于生產(chǎn)工藝的簡(jiǎn)化可控，減少了生產(chǎn)成本，大大提高了產(chǎn)品品質(zhì)(效價(jià)達(dá)到1400單位/毫克以上)，從而極大地提高了產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

1.高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下工藝步驟：(1)原料的選取：選取新鮮冷凍牛胰或豬胰；(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎機(jī)將冷凍原料直接粉碎成漿狀，加入2～5倍體積預(yù)冷的0.25N硫酸溶液，在2～8℃冷庫(kù)中攪拌提取3～5小時(shí)，放置過(guò)夜；次日將提取液進(jìn)行固液分離，分離后的殘?jiān)b袋后按照環(huán)保要求處理，在清液中加入硫酸銨至30％飽和度，并加入少量硅藻土助濾，在2～8℃冷庫(kù)中放置過(guò)夜后過(guò)濾，得到的清液即為提取液；(3)分級(jí)鹽析、酶原結(jié)晶：在提取液中再補(bǔ)充硫酸銨至70％飽和度，在2～8℃冷庫(kù)中放置過(guò)夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉淀；用1～5倍重量的冰水溶解上述沉淀，加入0.1～1倍重量的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至4～6，在20～30℃下保溫靜置40～60小時(shí)使糜蛋白酶原充分結(jié)晶，過(guò)濾得到糜蛋白酶原粗品，濾液回收；(4)粗品酶解：粗品用5～15倍體積的去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH到8.0，在每升溶解液中加入3～10mg胰蛋白酶，在2～8℃冷庫(kù)中酶解40～60小時(shí)，酶解后的溶液離心得到酶解液；(5)親和層析分離純化：以進(jìn)口GE?Health凝膠介質(zhì)為基礎(chǔ)，接上慈菇蛋白酶抑制劑作為配基得到親和層析介質(zhì)，將該親和層析介質(zhì)裝柱，用層析緩沖液進(jìn)行平衡；平衡后直接用酶解液上樣，控制流速在25～35cm/h；上樣完畢，用上述平衡液沖柱，沖至流出液的OD₂₈₀值小于0.1，保留穿透，測(cè)定穿透中的糜蛋白酶活性；換用洗脫液洗脫，流速為40～60cm/h，收集洗脫峰；(6)超濾濃縮除菌：采用超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，將濃縮液通過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌；(7)真空冷凍干燥得到成品：采用真空冷凍干燥技術(shù)，將酶液直接冷凍干燥，得到成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，固液分離采用的裝置為機(jī)電一體化箱式板框過(guò)濾設(shè)備。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)(3)中，硫酸銨采用試劑級(jí)進(jìn)行鹽析。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的濾液可供制胰蛋白酶原用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，酶解使用的胰蛋白酶為高純度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，層析緩沖液為：0.1M?Tris-HCl，pH8.0緩沖液，洗脫液為：0.1mol/L甲酸-0.05mol/L?KCl，pH2.2緩沖液。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(6)中，超濾膜的截流分子量為10000。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(7)中，真空冷凍干燥工序中酶液的冷凍溫度為-40℃以下。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度糜蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的步驟(7)中的成品效價(jià)大于1400單位/毫克。