本發明涉及一種灰楸葉片原生質體的制備方法，其以灰楸組培苗幼嫩葉片為材料，通過控制纖維素酶Onozuka RS、離析酶Macerozyme R?10的配比及濃度、酶解液中甘露醇濃度、酶解溫度、酶解時間等因素，獲得了灰楸葉片原生質體。本發明所述方法獲得的游離原生質體數量多，活力高，可為灰楸原生質體培養及植株再生、遺傳轉化、體細胞雜交、原生質體融合育種等研究奠定基礎。

1.一種灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)樣品篩選：取灰楸組培幼苗的幼嫩葉片,其中,所述的灰楸組培苗高度為6-8cm，選取從上往下第3-6片葉;(2)將選取的幼嫩葉片用刀片切成寬度不超過0.15mm的長條形，置于酶解液中，在搖床上黑暗條件下進行酶解，酶解溫度25-30℃；其中, 所述的酶解液組成：0.01M CaCl₂，0.02MKCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纖維素酶OnozukaRS，0.5％-3％離析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇;(3)酶解物經300目濾網過濾，將濾液500～700轉/min離心3～7min，吸去上清液，沉淀用緩沖液重懸，重復上述離心操作1次，沉淀用緩沖液重懸，即為原生質體懸浮液。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟：(4)原生質體的產量用血球計數板測定，重復3次，原生質體產量＝酶液中原生質體的數量/酶解所用葉條的質量；其中，原生質體產量的單位為個/克，原生質體的數量的單位為個，酶解所用葉條的質量的單位為克。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，還包括步驟：(5)原生質體懸浮液與0.01％酚藏花紅溶液1:1混合，染色5min，顯微鏡下測定原生質體的存活率，隨機選取5個視野進行統計，重復3次，原生質體存活率＝有活力的原生質體/原生質體總數×100％。4.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的酶解時間為6-14h。5.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(2)幼嫩葉片用刀片切成1.0mm×0.1mm的長條形，所述的搖床轉速為50rpm。6.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)酶解物經300目濾網過濾，將濾液600轉/min離心5min，吸去上清液，沉淀用緩沖液重懸，重復上述離心操作1次，沉淀用0.5mL緩沖液重懸。7.根據權利要求6所述的灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液的配制為：0.01MCaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，0.3-0.7M甘露醇。8.根據權利要求3所述的灰楸葉片原生質體的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的0.01％酚藏花紅溶液用0.6M甘露醇配制而成。