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一種灰楸葉片原生質的制備方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-09-28
  • 技術成熟度:已有樣品
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201611255964.6 
  • 技術(專利)名稱 一種灰楸葉片原生質的制備方法 
  • 項目單位 中國林業科學研究院林業研究所
  • 發明人 麻文俊,王軍輝,易飛 
  • 行業類別 藥品-化學藥品
  • 技術成熟度 已有樣品
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 王援朝
  • 發布時間 2021-09-28  
  • 01

    項目簡介

    本發明涉及一種灰楸葉片原生質體的制備方法,其以灰楸組培苗幼嫩葉片為材料,通過控制纖維素酶Onozuka RS、離析酶Macerozyme R?10的配比及濃度、酶解液中甘露醇濃度、酶解溫度、酶解時間等因素,獲得了灰楸葉片原生質體。本發明所述方法獲得的游離原生質體數量多,活力高,可為灰楸原生質體培養及植株再生、遺傳轉化、體細胞雜交、原生質體融合育種等研究奠定基礎。
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  • 02

    說明書

    1.一種灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟:(1)樣品篩選:取灰楸組培幼苗的幼嫩葉片,其中,所述的灰楸組培苗高度為6-8cm,選取從上往下第3-6片葉;(2)將選取的幼嫩葉片用刀片切成寬度不超過0.15mm的長條形,置于酶解液中,在搖床上黑暗條件下進行酶解,酶解溫度25-30℃;其中, 所述的酶解液組成:0.01M CaCl2,0.02MKCl,0.02M MES,0.1%BSA,1%-3%纖維素酶OnozukaRS,0.5%-3%離析酶Macerozyme R-10,0.3-0.7M甘露醇;(3)酶解物經300目濾網過濾,將濾液500~700轉/min離心3~7min,吸去上清液,沉淀用緩沖液重懸,重復上述離心操作1次,沉淀用緩沖液重懸,即為原生質體懸浮液。2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,還包括步驟:(4)原生質體的產量用血球計數板測定,重復3次,原生質體產量=酶液中原生質體的數量/酶解所用葉條的質量;其中,原生質體產量的單位為個/克,原生質體的數量的單位為個,酶解所用葉條的質量的單位為克。3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,還包括步驟:(5)原生質體懸浮液與0.01%酚藏花紅溶液1:1混合,染色5min,顯微鏡下測定原生質體的存活率,隨機選取5個視野進行統計,重復3次,原生質體存活率=有活力的原生質體/原生質體總數×100%。4.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,步驟(2)所述的酶解時間為6-14h。5.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,步驟(2)幼嫩葉片用刀片切成1.0mm×0.1mm的長條形,所述的搖床轉速為50rpm。6.根據權利要求1所述的灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,所述步驟(3)酶解物經300目濾網過濾,將濾液600轉/min離心5min,吸去上清液,沉淀用緩沖液重懸,重復上述離心操作1次,沉淀用0.5mL緩沖液重懸。7.根據權利要求6所述的灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,所述的緩沖液的配制為:0.01MCaCl2,0.02M KCl,0.02M MES,0.1%BSA,0.3-0.7M甘露醇。8.根據權利要求3所述的灰楸葉片原生質體的制備方法,其特征在于,步驟(5)所述的0.01%酚藏花紅溶液用0.6M甘露醇配制而成。
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