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阿卡波糖工程菌及其制備方法和應用

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-09-26
  • 技術成熟度:已有樣品
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201310282654.3 
  • 技術(專利)名稱 阿卡波糖工程菌及其制備方法和應用 
  • 項目單位 浙江海正藥業股份有限公司
  • 發明人 黃雋,李美紅,余貞 
  • 行業類別 藥品-化學藥品
  • 技術成熟度 已有樣品
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 尤蓓萍
  • 發布時間 2021-09-26  
  • 01

    項目簡介

    本發明涉及一種阿卡波糖工程菌、制備該工程菌的方法及該工程菌的應用。本發明的阿卡波糖工程菌是通過接合轉移的方法導入同源重組片段將游動放線菌的treY基因滅活而獲得。所述阿卡波糖工程菌發酵后,產生的阿卡波糖C組分雜質含量明顯降低。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種制備阿卡波糖工程菌的方法,所述方法是將生產阿卡波糖的游動
    放線菌中的treY基因滅活;所述滅活是通過將DNA片段M導入到游動放線
    菌中,使DNA片段M與游動放線菌的treY基因發生同源重組而完成;所述
    同源重組是通過將游動放線菌的菌絲與導入所述DNA片段M的重組菌共同培
    養進行接合轉移而完成,在將重組菌與游動放線菌共同培養進行接合轉移之
    前,將所述游動放線菌以37℃水浴20分鐘;
    所述DNA片段M,自5’端到3’端分別為同源臂T1、DNA片段N和同源
    臂T2;所述同源臂T1與treY基因的上游序列同源重組,所述同源臂T2與treY
    基因的下游序列同源重組,滅活treY基因;所述片段N為連接片段;其中,
    同源臂T1由treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸和treY基因上游片段組成,
    同源臂T2由treY基因編碼序列的3’端930bp核苷酸和treY基因下游片段組成,
    以限制性內切酶識別序列作為片段N。
    2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述同源臂T1為包括treY
    基因編碼序列的5’端785bp核苷酸的3057bp片段;所述同源臂T2為包括treY
    基因編碼序列的3’端930bp核苷酸的2885bp片段;所述片段N為BamHI酶
    識別序列。
    3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,所述DNA片段M的序列
    如SEQ?ID?NO:3所示。
    4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述導入DNA片段M的
    重組菌是將所述DNA片段M克隆至pUAmT14質粒的多克隆酶切位點而得到
    重組質粒pAT-tre12,再將重組質粒pAT-tre12轉化至包含質粒pUZ8002的大
    腸桿菌ET12567中所得到的重組菌;其中所述pUAmT14質粒的構建過程為:
    將克隆載體pUC19以Dra?I和Ssp?I雙酶切,將質粒pIJ773以Xba?I和BstB?I
    雙酶切,并補平末端,將上述兩個片段連接,得到質粒pUAmT14。
    5.根據權利要求1-4任一項所述的方法,其特征在于,所述游動放線菌
    是Actinoplanes?sp.SN223/29。
    6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述游動放線菌是游動放
    線菌8-22。
    7.根據權利要求1-6任一項所述的方法制備的阿卡波糖工程菌,其特征
    在于,所述工程菌中treY基因失活。
    8.根據權利要求7所述的阿卡波糖工程菌,其特征在于,所述阿卡波糖
    工程菌是游動放線菌tre12-2#,所述游動放線菌tre12-2#是游動放線菌8-22的
    treY基因與序列為SEQ?ID?NO:3的DNA片段M發生同源重組后產生的treY
    基因失活的游動放線菌。
    9.根據權利要求7或8所述的阿卡波糖工程菌在制備阿卡波糖中的應用。
    10.一種制備阿卡波糖的方法,其特征在于,所述方法使用權利要求7
    或8所述的阿卡波糖工程菌。
    11.DNA片段M,其特征在于,所述片段M自5’端到3’端分別為同源臂
    T1、DNA片段N和同源臂T2;所述同源臂T1與treY基因的上游序列同源重
    組,同源臂T1由treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸和treY基因上游片段
    組成;所述同源臂T2與treY基因的下游序列同源重組,同源臂T2由treY基
    因編碼序列的3’端930bp核苷酸和treY基因下游片段組成;所述片段N為連
    接片段,為限制性核酸內切酶識別序列。
    12.根據權利要求11所述的DNA片段M,其特征在于,所述同源臂T1
    為包括treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸的3057bp片段,所述同源臂T2
    為包括treY基因編碼序列的3’端930bp核苷酸的2885bp片段,所述片段N為
    BamHI酶識別序列。
    13.根據權利要求12所述的DNA片段M,其特征在于,所述DNA片段
    M的序列如SEQ?ID?NO:3所示。
    14.包含權利要求11-13任一項所述的DNA片段M的質?;蛑亟M菌。
    15.根據權利要求14所述的質粒或重組菌,其特征在于,所述質粒是
    pAT-tre12;所述重組菌是將質粒pAT-tre12轉化至包含質粒pUZ8002的大腸桿
    菌ET12567中所得到的重組菌;其中,將所述DNA片段M克隆至pUAmT14
    質粒的多克隆酶切位點而得到重組質粒pAT-tre12;所述pUAmT14質粒的構建
    過程為:將克隆載體pUC19以Dra?I和Ssp?I雙酶切,將質粒pIJ773以Xba?I
    和BstB?I雙酶切,并補平末端,將上述兩個片段連接,得到質粒pUAmT14。
    展開

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