本發(fā)明公開了一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，包括如下步驟：(1)固體培養(yǎng)：取氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌分別接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)：(3)分純；(4)發(fā)酵；(5)細胞磷脂組的提取；(6)LC-MS檢測；(7)多元統(tǒng)計分析；(8)過程分析；本發(fā)明通過對細胞總磷脂的提取和分析，多元統(tǒng)計方法分析所獲得的磷脂組學(xué)數(shù)據(jù)，對不同傳代數(shù)的維生素C生產(chǎn)菌株在單獨和混合培養(yǎng)條件下的磷脂分子分別進行定性和定量分析，找到與增強維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的磷脂分子和代謝途徑的分析提供了方法，對以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化具有重要的意義。

1.一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是包括如下步驟：
（1）固體培養(yǎng)：
取10–500μL保藏于體積濃度為15–30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌（Gluconobacter?
oxydans）和10–500μL保藏于體積濃度為15–30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?
megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28–35℃，培養(yǎng)24h–48h；
（2）種子培養(yǎng)：
將經(jīng)步驟（1）培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28–35℃，
200–280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，24h–48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；
將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為
2×10⁷–2×10¹⁰cfu/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸–2×10¹¹cfu/mL，在28–35℃，200–280
rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24h–48h為傳代周期，以體積比為1%–10%為傳代比接入新的種子培
養(yǎng)基中，傳代100–150天，在0–100或0–150天選3–5個取樣時間取3–5個樣；
（3）分純：
將步驟（2）獲得的3–5個傳代培養(yǎng)混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上，
28–35℃培養(yǎng)24h–48h；再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28–35℃，200–280rpm搖床振蕩培養(yǎng)
24h–48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；
（4）發(fā)酵：
將所述進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿
菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為
2×10⁷–2×10¹⁰cfu/mL，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸–2×10¹¹cfu/mL，在28–35℃，
200–280rpm搖床振蕩培養(yǎng)10h–15h；
（5）細胞磷脂組的提取：
①取在步驟（4）搖床振蕩培養(yǎng)10h–15h的三種細胞懸液100–200mL，1000–3000rpm離
心3–10min，去除上清液，保留細胞，用pH=7.2–7.4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1–3次，相同條件
離心，去除上清，得到細胞；
②將步驟①所得細胞制成干粉，稱取200–300mg細胞干粉，置于離心管A中，加入0.5–0.8
mL超純水，充分混勻；
③向離心管A中再加入2–4mL提取液，充分混勻；1000–3000rpm離心3–10min，使溶液
分層，取下層有機溶劑層，置于離心管B中；
④重復(fù)步驟③2–4次，至細胞完全沉降；
⑤向離心管B中，加入0.8–1.2mol/L?KCl水溶液0.5–1.5mL，充分混勻，2000–4000rpm離
心3–10min，除去含水溶性雜質(zhì)的上清；
⑥再向離心管B加入1–3mL超純水，充分混勻，2000–4000rpm離心3–10min，去上清；
⑦蒸餾或氮氣吹干步驟⑥所得混合物中的有機溶劑，得到總磷脂提取混合物；
⑧將所述總磷脂提取混合物溶于0.2–2mL儲存液中制成樣品，冷凍-40℃以下保存；
⑨檢測前，向所述樣品內(nèi)加入磷脂標準品，使磷脂標準品終濃度為0.5–1.5μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1–2:1，
所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為0.005–0.01%；
所述儲存液為含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1–4:1，
所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為0.005–0.01%；
（6）LC–MS檢測
采用LC–MS對步驟（5）獲得的加入了磷脂標準品的樣品進行檢測，得到維生素C生產(chǎn)菌
株傳代過程的磷脂組的分子結(jié)構(gòu)和含量數(shù)據(jù)；
（7）多元統(tǒng)計分析
將步驟（6）獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子含量數(shù)據(jù)，進行多元統(tǒng)計
分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的差異磷脂分子標志物；
（8）過程分析
將步驟（7）獲得的差異磷脂分子標志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析
這些磷脂分子變化的規(guī)律，進而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的磷脂分子及相關(guān)代
謝途徑，從而為以提高2–酮基–L–古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是
所述細胞制成干粉的方法為使用液氮在研缽內(nèi)研磨細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是
所述步驟（5）⑦中所述蒸餾為30–40℃減壓蒸餾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是
所述磷脂標準品為磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少兩種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是
所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾長度為每條
10–20個碳原子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株磷傳代過程脂組變化的方法，其特征是
所述LC–MS檢測條件為：
色譜柱：Hypersil?GOLD?Silica，其規(guī)格為150mm×2.1mm，5μm；
進樣量：10μL；
柱溫：25℃；
流動相A：氯仿89.5%，甲醇10%，氫氧化銨0.5%；
流動相B：氯仿55%，甲醇39%，氫氧化銨0.5%，水5.5%；
梯度程序：0–7min，20–30%B；7–15min30–40%B；15–20min40–50%B；20–25min50%
B；25–35min，50–20%B；35–45min，20%B；
離子化方式：ESI負離子方式；
掃描方式：MS?Scan；
掃描范圍：m/z400–900；
掃描速度：1000scan/s；
毛細管電壓：3KV；
錐孔電壓：30V；
萃取電壓3V；
離子源溫度：100℃；
脫溶劑氣溫度：350℃；
錐孔氣流量：50L/Hr
脫溶劑氣流量：400L/Hr；
進/出口能量：50；
碰撞能量：2；
HM1/LM1/HM2/LM2：15.0；
Ion?Energy1：1.0；
Ion?Energy2：2.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是
所述多元統(tǒng)計分析方法為Pareto預(yù)處理后進行主成分分析。