本發(fā)明公開了一種Hib多糖與精制破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)工藝，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT結(jié)合物制備兩個步驟，Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步驟：A1、多糖溶解，A2、多糖活化，A3、加入ADH進(jìn)行連接，A4、去除CNBr和ADH；Hib多糖-TT結(jié)合物制備包括以下子步驟：B1、加入TT溶液，B2、加入EDAC，B3、去除EDAC，得到多糖-TT偶聯(lián)物；B4、將多糖-TT偶聯(lián)物分離純化，洗脫，除菌過濾，得到多糖-TT結(jié)合物。本發(fā)明的有益效果是：提高了工作效率，省工省時，同時，節(jié)約了NaCl溶液的用量；本發(fā)明與傳統(tǒng)工藝采用的透析相比，減少了樣品被污染幾率。

1.一種Hib多糖與精制破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)工藝，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT結(jié)合物制備兩個步驟，所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步驟：A1、多糖溶解，稱取Hib多糖，加入滅菌后的注射用水溶解多糖；A2、多糖活化，按0.2～0.6倍Hib多糖的量加入CNBr進(jìn)行活化；A3、Hib多糖-AH衍生物的生成，加入ADH進(jìn)行連接；A4、提純，將生成的Hib多糖-AH衍生物提純；所述的Hib多糖-TT結(jié)合物制備包括以下子步驟：B1、多糖-AH?衍生物與TT混合，在多糖-AH?衍生物溶液中加入TT溶液，充分混勻后加入EDAC；B2、去除EDAC，去除EDAC，得到多糖-TT偶聯(lián)物；B3、分離純化，將多糖-TT偶聯(lián)物分離純化得到多糖-TT結(jié)合物；其特征在于：（1）多糖溶解中Hib多糖的終濃度為1～3mg/ml；（2）多糖活化中Hib多糖和CNBr反應(yīng)的pH為9.5～10.5，反應(yīng)時間為20～30min；（3）Hib多糖-AH衍生物的生成中加入ADH的量為Hib多糖量的2～5倍，Hib多糖與ADH反應(yīng)的pH為7.5～8.5，反應(yīng)時間為20～30min；（4）提純的具體方法為：用30～50KD的膜包，先用0.02～0.05mol/L的NaCl按1:1的體積比進(jìn)行稀釋，然后超濾至1/2體積，反復(fù)稀釋和超濾10～15次，完成后，用0.45μm濾膜過濾，即為多糖-AH衍生物；?（5）多糖-AH?衍生物與TT混合的具體方法為：在多糖-AH?衍生物溶液中加入等體積的濃度為1～3mg/ml的TT溶液，充分混勻，在2～8℃溫度下反應(yīng)20～30min，在pH為5.0～6.0時加入EDAC，充分混勻，并維持pH在5.0～7.0間反應(yīng)1.5～2個小時；（6）去除EDAC的方法為：用30～50KD的膜包，0.1～0.3mol/L的NaCl循環(huán)超濾5～10次；（7）分離純化的具體方法為：將多糖-TT偶聯(lián)物經(jīng)Sepharose?4FF凝膠柱分離純化，用0.1～0.15mol/L的NaCl溶液洗脫，收集V0起始部分的高分子偶聯(lián)物，并將收集到的洗脫液進(jìn)行除菌過濾，得到多糖-TT結(jié)合物，并置于2～8℃下保存。