本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種質(zhì)粒pCMV?RBE?TK1?N2?EF1α?hFIXml及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該質(zhì)粒含CMV啟動(dòng)子?RBE元件?TK1基因的篩選標(biāo)記的人凝血因子IX表達(dá)框架。該質(zhì)粒和rep表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用于構(gòu)建定點(diǎn)整合于AAVS1位點(diǎn)表達(dá)人類(lèi)凝血因子IX的穩(wěn)定細(xì)胞。使用該表達(dá)質(zhì)粒制備穩(wěn)定表達(dá)人類(lèi)凝血因子IX的穩(wěn)定細(xì)胞一方面正負(fù)雙重篩選可以防止細(xì)胞隨機(jī)突變導(dǎo)致的非整合細(xì)胞耐藥對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群純凈度的影響，提高表達(dá)效率；另一方面可以有效預(yù)防插入突變導(dǎo)致的基因突變和癌蛋白表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法取代人類(lèi)凝血因子IX表達(dá)框架可以構(gòu)建表達(dá)其它基因的具有定點(diǎn)整合以及正負(fù)篩選的質(zhì)粒。

1.一種含RBE順式元件、正負(fù)篩選元件的人凝血因子IX表達(dá)框架的質(zhì)粒，記為pCMV-
RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其特征在于該質(zhì)粒含有一個(gè)由CMV啟動(dòng)子RBE元件TK1基因組成
的篩選標(biāo)記；其序列為SEQ ID NO.5所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的含RBE順式元件、正負(fù)篩選元件的人凝血因子IX表達(dá)框架的
質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟為：
（1）構(gòu)建pCMV-TK1重組質(zhì)粒
將合成的攜帶XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通過(guò)DNA重組技術(shù)插入經(jīng)XbaI
和AflⅡ雙酶切的pcNDA3.1(-)/myc-His A載體，獲得pCMV-TK1質(zhì)粒；TK1基因DNA片段見(jiàn)SEQ
ID NO.1所示；
（2）擴(kuò)增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段
以質(zhì)粒pCMV-TK1為模板，用含Nhe I-RBE的上游引物和含Sal I的下游引物擴(kuò)增獲得
Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I DNA片段；所述上游引物為SEQ ID NO.2所示，所述下游引物
為SEQ ID NO.3所示；
（3）構(gòu)建pN2-EF1α-hFIXml重組質(zhì)粒
合成含啟動(dòng)子EF1α的人凝血因子FIX小基因的DNA片段，其5’端增加KpnI粘性酶切位
點(diǎn)，在3’端增加NotI粘性酶切位點(diǎn)；合成的攜帶KpnI和NotI粘性末端的hFIXml雙鏈DNA片
段，通過(guò)DNA重組技術(shù)插入經(jīng)KpnI和NotI雙酶切的pEGFP-N2，得到重組質(zhì)粒，記為pN2-EF1α-
hFIXml；
（4）構(gòu)建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml質(zhì)粒
“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”雙鏈DNA片段，通過(guò)DNA重組技術(shù)插入經(jīng)NheⅠ和SalⅠ雙酶
切的pN2-EF1α-hFIXml重組質(zhì)粒，獲得表達(dá)質(zhì)粒，記為pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其序
列為SEQ ID NO.5所示。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml在建立hFIX基因定點(diǎn)整合
系統(tǒng)修飾細(xì)胞系中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟為：
（1）構(gòu)建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS
pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml質(zhì)粒用Apl I消化，補(bǔ)平后連接獲得pCMV-RBE-TK1-N2-
EF1α-MCS質(zhì)粒，用于在MCS位點(diǎn)插入重組基因；
（2）建立hFIX基因定點(diǎn)整合系統(tǒng)修飾細(xì)胞系
合成的hFIX表達(dá)質(zhì)粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml和pRC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的
成細(xì)胞，使用阿昔洛韋和G418共同篩選，得到hFIX基因定點(diǎn)整合系統(tǒng)修飾細(xì)胞系。