1.可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物，其特征在于所述引物為：
VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；
VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、操作說明書
和檢測試劑；操作說明書和檢測試劑設在盒體內，所述檢測試劑包括裂解液、吸附液、洗滌
液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照。
3.如權利要求2所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征
在于包括以下步驟：
1）制備盒體；
2）配制檢測試劑：
裂解液為：5mol/L鹽酸胍，0.1mol/L?EDTA，去離子水定容至1L，pH為8.0；
吸附液為：將5g玻璃粉放在25～30mL水中懸浮，然后再加入等體積的硝酸反應，最后
重新加水懸浮即可；
洗滌液為：0.1mol/L氯化鈉，1mmol/L?EDTA，10mmol/L?Tris-HCl，去離子水定容至1L，
pH為7.5，再加入等體積的無水乙醇；
DEPC處理水：往超純水中加入DEPC至終濃度為0.1%，振蕩2h后，高溫高壓滅菌2次；
反轉錄反應液：每6μL反轉錄反應液含有1μL50mM?VHSN-R引物；1μL?dNTP混合物，
每種dNTP濃度為10mM；2μL5×Primescript緩沖液；0.25μL?RNase抑制劑；0.25μL逆轉錄酶，
購自中國大連寶生物公司；0.3μL甘油；1.2μL?DEPC處理水；
VHSV-PCR反應液：每18μL?VHSV-PCR反應液含有1μL10mM?VHSN-F引物；1μL10mM
VHSN-F引物；1μL?dNTP混合物，每種dNTP濃度為2.5mM；0.25μL?Taq?DNA聚合酶；2μL
10×PCR緩沖液；1.5μL甘油；11.25μL雙蒸水；
陰性對照：DEPC處理水；
陽性對照：將體外轉錄得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀釋到104拷貝/μL所得溶液；
3）將操作說明書、裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR
反應液、陽性對照和陰性對照置入盒體內，即得病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑
盒。
4.如權利要求3所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征
在于在步驟2）中，所述陽性對照的制備方法如下：
（1）引物設計，具體方法為：
根據已獲得的VHSV核蛋白基因序列，設計以下兩條用于構建體外轉錄VHSV核蛋白基因
RNA片段重組質粒pSP-VHSV的引物VHSV-long-F和VHSV-long-R，分別攜帶HindⅢ和BamH
Ⅰ酶切位點：
VHSV-long-F：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；
VHSV-long-R：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；
（2）含有檢測目的片段重組質粒pSP-VHSV的構建和作為陽性對照的RNA片段的制備，
具體步驟為：
a）pSP-VHSV重組質粒的構建
使用VHSV-long-R作為反轉錄引物，將病毒RNA樣品作為模板，經過反轉錄PCR反應，
獲得了目的片段，然后將獲得的逆轉錄產物作為模板進行PCR擴增，將PCR產物回收后用Hind
Ⅲ和BamHⅠ內切酶做雙酶切，再使用E.Z.N.A.TM?Cycle?Pure試劑盒（OMEGA，USA）回收酶
切產物，然后將酶切產物連接到pSP64poly(A)（Promega，USA）載體上，轉化至感受態
E.coliDH5α中，篩選陽性克隆并測序驗證；
b）體外轉錄獲得作為陽性對照的RNA片段
提取構建好的pSP-VHSV質粒，EcoRI線性化后回收質粒，再用Promega體外轉錄試劑盒
體外轉錄獲得小RNA片段，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA質量和濃度；根據
RNA分子量確定單位體積RNA分子數，按10倍梯度稀釋，分別稀釋為1×106到1×101拷貝/μL，
獲得濃度梯度的陽性RNA片段。
5.如權利要求3所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征
在于在步驟2）中，所述硝酸的濃度為68%。
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