1.可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物,其特征在于所述引物為:
VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示;
VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒,其特征在于設有盒體、操作說明書
和檢測試劑;操作說明書和檢測試劑設在盒體內,所述檢測試劑包括裂解液、吸附液、洗滌
液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照。
3.如權利要求2所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法,其特征
在于包括以下步驟:
1)制備盒體;
2)配制檢測試劑:
裂解液為:5mol/L鹽酸胍,0.1mol/L?EDTA,去離子水定容至1L,pH為8.0;
吸附液為:將5g玻璃粉放在25~30mL水中懸浮,然后再加入等體積的硝酸反應,最后
重新加水懸浮即可;
洗滌液為:0.1mol/L氯化鈉,1mmol/L?EDTA,10mmol/L?Tris-HCl,去離子水定容至1L,
pH為7.5,再加入等體積的無水乙醇;
DEPC處理水:往超純水中加入DEPC至終濃度為0.1%,振蕩2h后,高溫高壓滅菌2次;
反轉錄反應液:每6μL反轉錄反應液含有1μL50mM?VHSN-R引物;1μL?dNTP混合物,
每種dNTP濃度為10mM;2μL5×Primescript緩沖液;0.25μL?RNase抑制劑;0.25μL逆轉錄酶,
購自中國大連寶生物公司;0.3μL甘油;1.2μL?DEPC處理水;
VHSV-PCR反應液:每18μL?VHSV-PCR反應液含有1μL10mM?VHSN-F引物;1μL10mM
VHSN-F引物;1μL?dNTP混合物,每種dNTP濃度為2.5mM;0.25μL?Taq?DNA聚合酶;2μL
10×PCR緩沖液;1.5μL甘油;11.25μL雙蒸水;
陰性對照:DEPC處理水;
陽性對照:將體外轉錄得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀釋到104拷貝/μL所得溶液;
3)將操作說明書、裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR
反應液、陽性對照和陰性對照置入盒體內,即得病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑
盒。
4.如權利要求3所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法,其特征
在于在步驟2)中,所述陽性對照的制備方法如下:
(1)引物設計,具體方法為:
根據已獲得的VHSV核蛋白基因序列,設計以下兩條用于構建體外轉錄VHSV核蛋白基因
RNA片段重組質粒pSP-VHSV的引物VHSV-long-F和VHSV-long-R,分別攜帶HindⅢ和BamH
Ⅰ酶切位點:
VHSV-long-F:其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示;
VHSV-long-R:其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示;
(2)含有檢測目的片段重組質粒pSP-VHSV的構建和作為陽性對照的RNA片段的制備,
具體步驟為:
a)pSP-VHSV重組質粒的構建
使用VHSV-long-R作為反轉錄引物,將病毒RNA樣品作為模板,經過反轉錄PCR反應,
獲得了目的片段,然后將獲得的逆轉錄產物作為模板進行PCR擴增,將PCR產物回收后用Hind
Ⅲ和BamHⅠ內切酶做雙酶切,再使用E.Z.N.A.TM?Cycle?Pure試劑盒(OMEGA,USA)回收酶
切產物,然后將酶切產物連接到pSP64poly(A)(Promega,USA)載體上,轉化至感受態
E.coliDH5α中,篩選陽性克隆并測序驗證;
b)體外轉錄獲得作為陽性對照的RNA片段
提取構建好的pSP-VHSV質粒,EcoRI線性化后回收質粒,再用Promega體外轉錄試劑盒
體外轉錄獲得小RNA片段,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA質量和濃度;根據
RNA分子量確定單位體積RNA分子數,按10倍梯度稀釋,分別稀釋為1×106到1×101拷貝/μL,
獲得濃度梯度的陽性RNA片段。
5.如權利要求3所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法,其特征
在于在步驟2)中,所述硝酸的濃度為68%。
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