本發(fā)明提供一種檢測甲型流感病毒H7N9亞型的熒光定量RT-PCR試劑盒，對甲型流感病毒及H7N9型進(jìn)行檢測。本試劑盒包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、陽性對照品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、陰性對照品。本發(fā)明根據(jù)甲型流感病毒、H7、N9的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，引入RNaseP引物探針作為內(nèi)參，采用一步法四重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確的從標(biāo)本中檢測甲型流感病毒及H7N9亞型流感病毒。該試劑盒設(shè)計(jì)合理，具有極高的特異性、靈敏性和重復(fù)性，可應(yīng)用于甲型流感病毒H7N9亞型引起暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急診斷、快速篩查及發(fā)熱呼吸道癥候群中甲型流感病毒及H7N9亞型的流行病學(xué)的研究。

1.一種檢測甲型流感病毒H7N9亞型的熒光定量RT-PCR試劑盒,該試劑盒由定量RT-PCR反應(yīng)液管（1）、酶混合液管（2）、引物探針混合液管（3）、4個標(biāo)準(zhǔn)品管（4）、4個陽性對照品管（5）、陰性對照品管（6）和盒體（7）組成，定量RT-PCR反應(yīng)液管（1）裝有定量RT-PCR反應(yīng)液，酶混合液管（2）裝有酶混合液，其特征在于，引物探針混合液管（3）裝有引物探針混合液，4個標(biāo)準(zhǔn)品管（4）分別裝有甲型流感病毒、H7、N9、RNase?P的標(biāo)準(zhǔn)品，4個陽性對照品管（5）分別裝有甲型流感病毒、H7、N9、RNase?P的陽性質(zhì)粒樣品；其中定量RT-PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐熱Taq?DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液包含四組引物和相應(yīng)的四種不同熒光標(biāo)記的探針，陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為甲型流感病毒、H7、N9、RNase?P的陽性質(zhì)粒樣品；熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列如下：上游引物Influenza?A-F:?5’-?GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’下游引物Influenza?A-R：5’-?GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’特異性探針I(yè)nfluenza?A-P:?5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’上游引物H7-F:?5’-?GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’下游引物H7-R:?5’-?CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’特異性探針H7-P:?5’-FAM-?ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’上游引物N9-F:?5’-?GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’下游引物N9-R:?5-?ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA-3’特異性探針N9-P:?5’-VIC-?TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA-BHQ1-3’上游引物RNase?P-F:?5’-?AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’下游引物RNase?P-R：5’-?GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’特異性探針RNase?P-P:?5’-CY5-?TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’????所述標(biāo)準(zhǔn)品由甲型流感病毒、H7、N9及核酶RNase?P標(biāo)準(zhǔn)品組成，其保守區(qū)基因序列如下：甲型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為：CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGGH7標(biāo)準(zhǔn)品序列為：CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTN9標(biāo)準(zhǔn)品序列為：GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGGRNase?P標(biāo)準(zhǔn)品序列為：CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC?所述甲型流感病毒、H7、N9及RNase?P的特異性探針分別采用ROX、FAM、VIC和CY5四種不同熒光標(biāo)記。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測甲型流感病毒H7N9亞型的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為包含甲型流感病毒、H7、N9、RNase?P的保守區(qū)基因序列的陽性質(zhì)粒樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測甲型流感病毒H7N9亞型的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于，所述的試劑盒保存于-20℃，引物探針混合液管（3）選用棕色管。