本發(fā)明公開了一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法：(1)采集氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA；(3)檢測：進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：建立陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲線；(5)判斷氣溶膠樣本中是否含有口蹄疫病毒。本發(fā)明還公開了特異性引物(如SEQ？ID？NO.1～8所示)以及試劑盒(由特異性引物、RT反應(yīng)緩沖液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Premix？Ex？Taq？II、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、無RNase的水組成)。本發(fā)明的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒既可用于養(yǎng)殖場氣溶膠的口蹄疫病毒檢測和血清型分型，也可用于臨床樣本的直接檢測，還可用于科學(xué)研究等非疾病的診斷。

1.一種非診斷目的的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：步驟如下：
(1)采集氣溶膠樣本；
(2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA；
(3)檢測：以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進(jìn)行SYBRGreenⅠ實時熒光定量
PCR，具體如下：
所述試劑盒由特異性引物、RT反應(yīng)緩沖液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、SYBRPremixExTaq^TM
II、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、無RNase的水組成；
所述標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒包括陽性質(zhì)粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、
pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQIDNO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序
列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-O-VP1是由IDNO.10所示的序列片段與pEASY-T3載體相連
接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-A-VP1是由SEQIDNO.11所示的序列片段與pEASY-T3載體
相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-A1-VP1是由SEQIDNO.12所示的序列片段與pEASY-T3載
體相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對和O型、A型、Asia1型3種血清型口
蹄疫病毒鑒別檢測引物對；
所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下：
引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’；
引物2-5’UTR-R：5’-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’；
O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物3-O-VP1F：5’-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’；
引物4-O-VP1R：5’-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’；
A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物5-A-VP1F：5’-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’；
引物6-A-VP1R：5’-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’；
Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物7-A1-VP1F：5’-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’；
引物8-A1-VP1R：5’-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’；
(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：建立陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲
線；
(5)判斷：當(dāng)所用特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對時，若溶解曲線為S型曲
線，則表明氣溶膠樣本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不
含有口蹄疫病毒；
當(dāng)所用特異性引物為O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對時，
若對應(yīng)于O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有O型
口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有O型口蹄疫病毒；
若對應(yīng)于A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有
A型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有A型口蹄疫病毒；
若對應(yīng)于Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中
含有Asia1型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有Asia1型口
蹄疫病毒；
所述步驟(3)中，PCR的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：20μL的擴(kuò)增體系，包括2×SYBRPremixEx
TaqII10μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，陽性質(zhì)粒1μL，RNaseFree
ddH₂O補足20μL；
所述步驟(3)中，PCR的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃30s，然后按照95℃變性5s、65℃退火
延伸30s，進(jìn)行40個循環(huán)；溶解曲線為95℃5s、65℃60s、95℃繼續(xù)；最后50℃30s結(jié)束反
應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步驟(1)
中，采集氣溶膠樣本的方法為：采用MS-1型多功能微生物采樣器，以10mLpH值7.0的磷酸
鹽緩沖液為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集氣溶膠樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步驟(2)
中，提取cDNA的方法為：取2mL氣溶膠樣本，應(yīng)用病毒RNA提取試劑盒提取總RNA；
再應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。
4.用于檢測口蹄疫病毒的特異性引物，其特征在于：所述特異性引物為口蹄疫病毒檢測
的通用引物對和O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對；
所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下：
引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’；
引物2-5’UTR-R：5’-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’；
O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物3-O-VP1F：5’-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’；
引物4-O-VP1R：5’-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’；
A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物5-A-VP1F：5’-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’；
引物6-A-VP1R：5’-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’；
Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物7-A1-VP1F：5’-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’；
引物8-A1-VP1R：5’-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’。
5.權(quán)利要求4所述的特異性引物在制備檢測口蹄疫病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
6.一種用于檢測口蹄疫病毒的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由特異性引物、RT反
應(yīng)緩沖液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、SYBRPremixExTaq^TMII、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、無RNase的水組成；
所述標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒包括陽性質(zhì)粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、
pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQIDNO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序
列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-O-VP1是由IDNO.10所示的序列片段與pEASY-T3載體相連
接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-A-VP1是由SEQIDNO.11所示的序列片段與pEASY-T3載體
相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述陽性質(zhì)粒pEASY-T3-A1-VP1是由SEQIDNO.12所示的序列片段與pEASY-T3載
體相連接后得到的重組質(zhì)粒；
所述特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對和O型、A型、Asia1型3種血清型口
蹄疫病毒鑒別檢測引物對；
所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下：
引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’；
引物2-5’UTR-R：5’-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’；
O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物3-O-VP1F：5’-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’；
引物4-O-VP1R：5’-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’；
A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物5-A-VP1F：5’-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’；
引物6-A-VP1R：5’-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’；
Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：
引物7-A1-VP1F：5’-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’；
引物8-A1-VP1R：5’-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’。