1.一種人季節性流感病毒H1N1(HuH1N1)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒,包含有
一條序列表中序列1所示的人季節性流感病毒H1N1即HuH1N1的靶標核酸的捕獲探針,一對
用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生HuH1N1靶標核酸的DNA拷貝的HuH1N1檢測引物T7和nT7,
和一條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據所述HuH1N1靶標核酸的DNA拷貝產生的RNA拷貝
特異結合的HuH1N1檢測探針;所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示;所述
HuH1N1檢測引物由T7引物和nT7引物組成,T7引物序列如序列表中序列3所示,nT7引物序列
如序列表中序列4所示;所述HuH1N1檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端標
記FAM熒光基團,3’端標記DABCYL淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和
T7 RNA聚合酶,所述M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中,所述捕獲探針存
在于一核酸提取液中,所述T7引物、nT7引物和HuH1N1檢測探針存在于一HuH1N1檢測液中。
3.根據權利要求2所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包含有HuH1N1內標和內標
檢測探針;所述HuH1N1內標為HuH1N1核苷酸序列的競爭性內標,可與捕獲探針特異性結合,
并使用同一對引物即T7和nT7引物,由序列表中序列7所示的HuH1N1 IC RNA;所述內標檢測
探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端標記HEX熒光基團,3’端標記DABCYL淬滅基
團,且所述內標檢測探針存在于HuH1N1檢測液中。
4.根據權利要求3所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗
滌液、HuH1N1反應液、HuH1N1檢測液、SAT酶液、HuH1N1陽性對照、HuH1N1陰性對照和HuH1N1
內標,其中:
裂解液:含硫酸銨(NH4)2SO4和HEPES;
核酸提取液:含捕獲探針和磁珠;
洗滌液:含NaCl和SDS;
HuH1N1反應液:含dNTP和NTP;
HuH1N1檢測液:含T7引物、nT7引物、HuH1N1檢測探針和內標檢測探針;
SAT酶液:含M-MLV反轉錄酶、T7 RNA聚合酶;
HuH1N1陽性對照;含人季節性流感病毒H1N1 HA基因的體外轉錄RNA稀釋物;
HuH1N1陰性對照:不含有人季節性流感病毒H1N1靶標核酸序列或不含有甲型流感病毒
的溶液;
HuH1N1內標:HuH1N1 IC RNA。
5.根據權利要求4所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒中一個反應單位中各種試劑
組成如下:
(1)裂解液:HEPES 25-250mM,(NH4)2SO45-50mM;
(2)核酸提取液:HEPES 50-400mM,EDTA 40-200mM,LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50μ
M,磁珠50-500mg/L;
(3)洗滌液:HEPES 5-50mM,NaCl 50-500Mm,1%SDS,EDTA 1-10mM;
(4)HuH1N1反應液:Tris 10-50mM,MgCl210-40mM,dNTP 0.1-10mM,NTP 1-20mM,PVP40
1-10%,KCl 5-40mM;
(5)HuH1N1檢測液:將HuH1N1檢測引物和HuH1N1檢測探針溶解在TE溶液即10mM Tris和
1mM EDTA的混合液中配制而成,各引物和探針濃度在5-15pmol/反應;
(6)SAT酶液:M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應、2-10mM
HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM
trehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1%(v/v)
Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol;
(7)HuH1N1陽性對照;含102-105拷貝/mL人季節性流感病毒H1N1HA基因的體外轉錄RNA
稀釋物;
(8)HuH1N1陰性對照:不含有人季節性流感病毒H1N1靶標核酸RNA序列或不含有甲型流
感病毒的溶液;
(9)HuH1N1內標:含102-105拷貝/mL HuH1N1 HA基因的體外轉錄RNA稀釋物。
6.根據權利要求5所述的試劑盒,其特征在于:核酸提取液中,捕獲探針的濃度為5-25μ
M,磁珠用量為50-250mg/L;HuH1N1反應液中,dNTP濃度為0.5-5mM,NTP濃度為1-10mM;
HuH1N1檢測液中,T7引物濃度為10pmol/反應,nT7引物濃度為10pmol/反應,HuH1N1檢測探
針濃度為8pmol/反應,內標檢測探針濃度為8pmol/反應;SAT酶液中,M-MLV反轉錄酶500-
1500U/反應,T7 RNA聚合酶500-1000U/反應。
7.根據權利要求5或6所述的試劑盒,其特征在于:由A盒即標本處理單元和B盒即核酸
擴增檢測單元組成,其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液,B盒包裝所述
HuH1N1反應液、HuH1N1檢測液、SAT酶液、HuH1N1陽性對照、HuH1N1陰性對照及HuH1N1內標。
8.根據權利要求5或6所述的試劑盒,其特征在于:所述HuH1N1陽性對照中的體外轉錄
的HuH1N1 RNA以下述方法制備:
(1)用化學合成法合成HuH1N1 HA基因中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列
區域的片段,其核苷酸序列如序列表中序列8所示;
(2)將片段克隆到pGEM-T載體中,構建HuH1N1陽性對照質粒;
(3)HuH1N1陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5α中,命名為pGEM-T-HuH1N1菌株,貯存于-
70℃;
(4)純化去除DNA,并定量、鑒定RNA;或
存在HuH1N1內標時,體外轉錄的HuH1N1 IC RNA以下述方法制備:
(1)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同,其他序列同HuH1N1靶標序列區
域的片段,其核苷酸序列如序列表中序列9所示;
(2)將片段克隆到pGEM-T載體中,構建HuH1N1內標質粒;
(3)HuH1N1內標質粒轉化到大腸桿菌DH5α中,命名為pGEM-T-HuH1N1 IC菌株,貯存于-
70℃;
(4)純化去除DNA,并定量、鑒定內標RNA。
展開