本發(fā)明公開了一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法及其ISSR-PCR引物及試劑盒，該ISSR-PCR引物的堿基序列表示如下：5’-ACGAGAGAGAGA-3’。本發(fā)明通過提供對(duì)霍亂弧菌流行株具有特異性分子鑒定作用的1條ISSR-PCR引物，及包含上述引物的試劑盒及檢測(cè)方法，來檢測(cè)某一分離獲得的霍亂弧菌菌株基因組DNA，進(jìn)而確定該霍亂弧菌菌株是否為流行株。本發(fā)明所述分子鑒定方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)便；②成本低廉；③特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確的區(qū)分霍亂弧菌流行株和非流行株；④重復(fù)性好。

1.一種霍亂弧菌流行株分子鑒定用ISSR-PCR引物，其特征在于：所述引物的堿基序列
表示如下：
引物pGA5：5’-ACGAGAGAGAGA-3’。
2.一種霍亂弧菌流行株分子鑒定用試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所
述的引物pGA5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括2×ISSR-PCR反應(yīng)液和
Taq?DNA聚合酶，所述2×ISSR-PCR反應(yīng)液包括如下組分：
20mM的pH8.3的Tris-HCl，100mM的KCl，4mM的MgCl₂，0.6mM的dNTP，
2.4μM的引物pGA5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：試劑盒反應(yīng)體系總體積為25μL，含有
2×ISSR-PCR反應(yīng)液12.5μL，待檢測(cè)基因組DNA100ng～500ng，Taq?DNA聚合酶為
1.5U，其余為滅菌超純水。
5.一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟：
（1）提取待測(cè)試樣品DNA；
（2）采用如權(quán)利要求2～4任一所述的試劑盒對(duì)待測(cè)試樣品DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增
和電泳；
（3）分析電泳圖譜，判定檢測(cè)結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于：所述鑒定方法還包括3個(gè)參比對(duì)照DNA：
分別為O1群霍亂弧菌非流行株DNA、O1群霍亂弧菌流行株DNA及O139群霍亂弧
菌流行株DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于：所述鑒定方法的ISSR-PCR反應(yīng)條件是：
95℃預(yù)變性3min，然后在94℃40sec，45℃60sec，72℃120sec條件下進(jìn)行3步PCR
循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)為30次，最后在72℃保溫10min。