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結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-26
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201610537898.5 
  • 技術(專利)名稱 結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法 
  • 項目單位 中國水產科學研究院珠江水產研究所
  • 發明人 葉星,董浚鍵,趙立祥,曾慶凱,孫成飛,田園園 
  • 行業類別 中藥材獲取-植物藥材種植
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 王欣如
  • 發布時間 2021-12-26  
  • 01

    項目簡介

    本發明提供一種結合RT?PCR與NEST?PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒和檢測方法。設計巢式PCR反應(NEST?PCR),以RT?PCR反應產物作為模板,進行NEST?PCR擴增,有效提高了檢測的靈敏度,可檢測到攜帶較低病毒拷貝數的樣品。
    展開
  • 02

    說明書

    1.結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒,其特征在于,包括:(1)一步法RT-PCR反應混合液:25μL的反應體系中,包括One Step Enzyme Mix1μL,2×1 Step Buffer12.5μL,引物對1的濃度為0.4μM,所述引物對1具有SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列,具體地,引物對1的序列如下:正向引物:CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO:1)反向引物:TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO:2)(2)NEST-PCR反應混合液:20μL的反應體系中,包括Premix Taq Mix10μL,引物對2的濃度為0.4μM,所述引物對2具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列,具體地,引物對2的序列如下:正向引物:TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO:3)反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO:4)2.根據權利要求1所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒,其特征在于,使用方法包括:(1)、RNA的獲?。禾崛〈郎y草魚組織的總RNA,作為RT-PCR反應的模板;(2)、RT-PCR擴增:采用25μL的擴增體系,將反應混合液置于PCR儀進行RT-PCR擴增,所述反應混合液中,包括步驟(1)獲取的RNA模板2μL,One Step Enzyme Mix1μL,2×1 StepBuffer12.5μL,引物對1的濃度為0.4μM,余量由DEPC處理水補足,放入PCR儀進行RT-PCR擴增,其中,所述引物對1具有SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列,具體地,引物對1的序列如下:正向引物:CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO:1)反向引物:TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO:2)(3)、檢測RT-PCR擴增結果:取RT-PCR擴增產物,用1%的瓊脂糖凝膠電泳后,置于凝膠成像系統中成像,電泳圖片在349bp大小處有條帶,則確定該樣品攜帶草魚出血病病毒GCRV-GD108株,若電泳圖片在349bp大小處沒有條帶,則繼續進行步驟(4);(4)、NEST-PCR擴增:以電泳圖片在349bp大小處沒有條帶的RT-PCR擴增產物作為模板,進行NEST-PCR擴增,采用20μL的擴增體系:DNA模板2μL,EX Taq Mix10μL,引物對2的濃度為0.4μM,其余為由滅菌ddH2O補足,其中,所述引物對2具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列,具體地,引物對2的序列如下:正向引物:TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO:3)反向引物:ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO:4)(5)、檢測NEST-PCR擴增結果:取NEST-PCR擴增產物,用1%的瓊脂糖凝膠電泳后,置于凝膠成像系統中成像,電泳圖片在206bp大小處有條帶,判定該樣品帶有草魚出血病病毒GCRV-GD108株。3.根據權利要求2所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒,其特征在于,所述步驟(1)具體包括:A、組織預處理:樣品預處理:取待測草魚樣品的組織300mg,加入600μL TN緩沖液,勻漿,室溫12000g離心15min,取上清;所述TN緩沖液為20mM Tris-HCl、0.4M NaCl,其pH為7.4;所述勻漿操作為使用電動勻漿機打5次,每次5-6sec;B、Trizol試劑提取病毒RNA:在1mL Trizol試劑中加入150μL粗提取液,依照Trizol試劑提取RNA的步驟進行,最后溶解30uL DEPC水中,用槍頭輕打幾次或室溫20min,直接用于RT-PCR擴增,或-20度短暫保存、或-80℃冰箱保存。4.根據權利要求2所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒,其特征在于,所述步驟(4)中,NEST-PCR擴增的條件為:94℃,預變性2min;進入35個循環:98℃10sec,56℃30sec,72℃50sec;最后一個循環結束后72℃延伸10min,4℃保存。
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專利技術附圖

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