本發(fā)明公開了檢測口蹄疫病毒(FMDV)非結構蛋白(NSP)抗體的單克隆抗體阻斷ELISA試劑盒及方法(FMD NSP B-ELISA)，包括酶標反應板、血清稀釋液、25倍濃縮洗滌液、底物溶液、100×濃縮酶標檢測抗體、終止液、陽性對照血清和陰性對照血清；所述酶標反應板為兩塊96孔高親合力酶標板，先包被了6×組氨酸單克隆抗體或非結構蛋白2C多克隆抗體，并通過單抗或多抗將原核表達的帶6×組氨酸標簽的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非結構蛋白捕獲；本方法與其他同類試劑盒相比有較高的符合率，而且本方法有更高的陽性血清檢出率，適于檢測牛、羊與豬等多種易感動物血清。

1.檢測口蹄疫病毒非結構蛋白抗體的單克隆抗體阻斷ELISA試劑盒，其特
征在于，包括酶標反應板、血清稀釋液、25倍濃縮洗滌液、底物溶液、100×濃
縮酶標檢測抗體、終止液、陽性對照血清和陰性對照血清；所述酶標反應板為兩
塊96孔高親合力酶標板，先包被了非結構蛋白2C多克隆抗體，并通過2C多抗將
原核表達的口蹄疫病毒2C3AB非結構蛋白捕獲于酶標板；所述血清稀釋液：含10
％馬血清，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸鹽(PBS)溶
液；所述25倍濃縮洗滌液：500mL超純水中加NaCl?200g、KCl5g、
Na₂HPO₄·12H₂O72.5g、
KH₂PO₄5g和12.5mL吐溫20，補超純水定容至1000mL，pH為7.4，高壓滅菌，室
溫存放備用；
所述底物溶液：為單組份3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物；
所述100×濃縮酶標檢測抗體：為辣根過氧化物酶標記的口蹄疫病毒3B非結構蛋
白單克隆抗體，該單克隆抗體針對3B蛋白中₂₄GPYAGPMER₃₂位表位，是3B蛋白中
的自然優(yōu)勢抗原表位，不同血清型病毒之間相對保守；通過將HRP標記的3B單
克隆抗體稀釋于抗體保存液中制備；
所述終止液：0.3M?H₂SO₄溶液，利用超純水稀釋分析純濃硫酸配制而成；
所述陽性對照血清：采自口蹄疫病毒感染后1～3個月的牛、羊或豬，經檢測，
非結構蛋白抗體與結構蛋白抗體均為陽性，經無菌處理后加保存劑制備；
所述陰性對照血清：采自非免疫健康牛、羊和豬，經檢測口蹄疫病毒結構蛋白與
非結構蛋白抗體均為陰性，經無菌處理后加保存劑保存；檢測口蹄疫非結構蛋白
抗體的單克隆抗體阻斷ELISA方法，
步驟：
A1、于血清稀釋板中，將待測血清按1∶5比例稀釋于血清稀釋液中，吸取稀
釋好的樣品液加入包被好抗原的酶標板中，每孔加入100μL，室溫過夜振蕩作用
18-24h；
A2、次日，用1×PBST洗滌液洗板，反復洗5次，最后一次拍干；
A3、將100×濃縮的酶標抗體1∶100稀釋至血清稀釋液中，加入酶標板，每
孔加入100μL，37℃作用1小時；
A4、同上洗滌，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10-15分
鐘，再底物作用過程中，要注意掌握顯色程度，加終止液之前可以通過測定650nm
吸光值來確定顯色程度，于OD₆₅₀值接近0.7時終止反應，檢測效果最佳；
A5、加終止液，每孔100μL，輕振混勻，于10分鐘內用酶標儀讀450nm吸光值
(OD₄₅₀)；
A6、阻斷率計算：阻斷率(PI)＝1-樣品OD₄₅₀/陰性對照OD₄₅₀；
A7、試驗成立的條件：陰性對照OD₄₅₀值-陽性對照OD₄₅₀值≥0.8，且陽性對照
阻斷率應≥60％；
A8、判定標準：牛、羊與豬血清阻斷率大于或等于0.46判為非結構蛋白2C3AB
抗體陽性，血清阻斷率小于0.46判為非結構蛋白2C3AB抗體陰性。