本發明公開了半巢式-RT-Realtime PCR檢測馬鈴薯X病毒的試劑盒，包括TaqMan探針與引物的設計、植物總RNA提取及質量控制、將RNA反轉錄合成cDNA和實時熒光PCR檢測。本方法有機地結合了實時熒光PCR和巢式PCR技術：在實時熒光PCR引物的外側按照巢式PCR的設計原理增設了一條正鏈引物，反鏈引物分別與兩條正鏈引物配對形成兩套獨立的PCR反應，并共用一條TaqMan探針。本發明的優點在于：引物極高的擴增效率保證了檢測的高靈敏度，有效提高了檢測的靈敏度，三條引物形成的兩套PCR體系進行相互驗證，極大地提高了檢測的準確性，簡化了操作并縮短了檢測周期，全封閉的操作系統減少了污染。

1.半巢式-RT-Realtime?PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：
根據馬鈴薯X病毒全基因組中外殼蛋白基因序列保守區，設計三條引物和一條TaqMan
探針；
(1)從植物葉片中提取總RNA并測定其OD值；
(2)將提取的植物總RNA反轉錄合成cDNA；
(3)實時熒光PCR檢測，包括引物探針的特異性檢測和靈敏度檢測；
所述的三條引物和一條TaqMan探針，其中一條上游引物序列為：
5’-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3’；另一條上游引物序列為：
5’-GGCCAGGGCACAATCCA-3’；下游引物序列為：
5’-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3’；探針序列為：5’FAM-
CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-3’TAMRA。
2.根據權利要求1所述的半巢式-RT-Realtime?PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法，其特征在
于所述的特異性檢測方法為：以步驟(2)中合成的cDNA為模板進行引物探針特異性實
時熒光PCR試驗；其中，步驟(1)中所述植物葉片是感染馬鈴薯X病毒的植物葉片以及
其它相應的對照植物葉片。
3.根據權利要求1所述的半巢式-RT-Realtime?PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法，其特征在
于所述的靈敏度檢測方法為：將上述步驟(2)中提取的感染馬鈴薯X病毒的植物葉片總
RNA進行梯度稀釋，并分別反轉錄合成cDNA，然后進行實時熒光PCR檢驗。
4.根據權利要求1所述的半巢式-RT-Realtime?PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法，其特征在
于所述的反轉錄合成cDNA的方法為：在反應體系中加入緩沖液、反轉錄酶及其緩沖液、
隨機引物和植物總RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反應條件為：37℃、15分鐘，85℃、5
秒，合成cDNA；所述的緩沖液為5×PrimeScript^TM?Buffer；所述的反轉錄酶及其緩沖液
為PrimeScript^TM?RT?Enzyme?Mix?I，所述的隨機引物為Oligo?dT?Primer和Random?6?
mers。