本發明公開了一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。本發明利用雙重實時熒光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作為靶基因，toxR基因用于特異性檢測副溶血性弧菌，tdh基因用于檢測是否攜帶毒力基因，優化設計引物、探針和反應條件，使得在一次擴增反應中對副溶血性弧菌進行特異性檢測的同時檢測其毒力基因，檢測快速，8-10小時可以完成從制備樣品到出具檢測結果的過程，不受假陽性和交叉污染等干擾，結果可靠，且靈敏度高、特異性強，為副溶血性弧菌進行流行病學調查提供了有利工具。適用于食品以及海產品的檢驗檢疫，可供檢驗檢疫局、疾病預防控制中心和質量監督部門對樣品進行簡便、快速、準確的檢測。

1.一種副溶血性弧菌(Vibrio?Parahaemolyticus)雙重實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所
述的檢測引物如下所示：
針對toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；
針對tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`。
2.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：
toxR基因的探針：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；
tdh基因的探針：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；
探針的5`端標記有熒光報告基團，3`端標記有熒光淬滅基團，兩探針的5`端標記的熒光
報告基團是不同的熒光報告基團。
3.根據權利要求2所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的熒
光報告基團為FAM、HEX或VIC，所述的熒光淬滅基團為BHQ1。
4.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反應液、耐熱
DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，
所述的檢測引物包括兩對：
(1)針對toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；
(2)針對tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；
所述的檢測探針包括：
(1)toxR基因的探針：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；
(2)tdh基因的探針：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；
探針的5`端標記有熒光報告基團，3`端標記有熒光淬滅基團，兩探針的5`端標記的熒光
報告基團是不同的熒光報告基團。
5.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，用于檢測食品或海產品，其特征在于，包
括以下步驟：
(1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；
(2)使用權利要求1所述的針對toxR基因和tdh基因的檢測引物和權利要求2所述的toxR
基因和tdh基因的檢測探針，與實時熒光PCR擴增用的反應液及耐熱DNA聚合酶混
合形成擴增反應體系；
(3)將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應，反應結束后，根據探針
標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次
數(Ct)；
(4)根據各樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌，
以及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。
6.根據權利要求5所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步
驟(2)的擴增反應體系為：模板DNA、2μL；10×TaqMan緩沖液、5μL；5mmol/L?MgCl₂、
4μL；2.5mmol/L?dNTPs、2μL；20μmol/L?TaqMan探針、兩種探針各1μL，共2μL；20μmol/L
檢測引物、四條引物各1μL，共4μL；0.55U?UNG酶、0.2μL；2.5U/μL?Taq聚合酶、3μL；
去離子水、7.8μL。
7.根據權利要求5或6所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述步
驟(3)的進行實時熒光PCR反應，其反應參數為：95℃30s、93℃5s、60℃30s、40個循
環。