本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法，包括以下步驟：血漿cfDNA提取、BCR H鏈的全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增、兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序、免疫組庫精準(zhǔn)信息分析。上述三次PCR擴(kuò)增的引物分別如SEQ ID NO.1?28、SEQ ID NO.29?77、SEQ ID NO.78?79所示。本發(fā)明還提供了含有上述引物的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR的試劑盒。本發(fā)明方法以及試劑盒能夠同時(shí)檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)信息分析和免疫組庫各亞克隆的精確定量，在無創(chuàng)檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.一種非診斷目的的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法，包括以下步驟：
(1)血漿cfDNA提取；
(2)BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增；
步驟(2)中BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條，序列分別如SEQ ID
NO.1-22所示，下游引物共6條，序列分別如SEQ ID NO.23-28所示；
TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條，序列分別如SEQ ID NO.29-73所示，
下游引物共4條，序列分別如SEQ ID NO.74-77所示；
(3)步驟(2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增；其中，步驟(3)所述的兩種擴(kuò)
增產(chǎn)物分別是指BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中片段大小在300-350bp的片段回收純化后
的產(chǎn)物、以及TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中片段大小在200-250bp的片段回收純化后的產(chǎn)
物；
(4)高通量測(cè)序；
(5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析，包括以下步驟：
1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置，7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成4⁷種唯一標(biāo)簽，
將成對(duì)測(cè)序序列的測(cè)序序列1和測(cè)序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連，形成14bp的一條索
引，并且以這14bp作為的成對(duì)測(cè)序序列索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將來源于同一個(gè)DNA模板
的所有測(cè)序序列聚集到一起的目的；
2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測(cè)序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢明距
離，將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇，每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測(cè)序序列的漢
明距離不超過3，以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測(cè)序序列的目的；
3)對(duì)于每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段中的測(cè)序序列的每一個(gè)測(cè)序堿基進(jìn)行互
相比對(duì)，若某種堿基型在測(cè)序序列中的一致率達(dá)到80％，則記新測(cè)序序列的這個(gè)堿基為此
堿基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測(cè)序序列，通過這種方法矯
正，可以有效去除測(cè)序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；
4)對(duì)新測(cè)序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測(cè)序序列；
5)根據(jù)4)中得到的測(cè)序序列與IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行
比對(duì)注釋，同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記，對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì)定量；
6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析，免疫組庫表達(dá)譜分析、Biomarker分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的方法，其特征在于，步驟(2)中，各條上游引物的
濃度相同，各條下游引物的濃度相同，且下游單個(gè)引物濃度為上游單個(gè)引物濃度的20倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的方法，其特征在于，步驟(2)中BCR H鏈全長(zhǎng)多重
PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性45s；98℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72
℃終延伸60s；4℃保持。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的方法，其特征在于，步驟(2)中TCRβ鏈CDR3多重
PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性45s；98℃變性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72
℃終延伸60s；4℃保持。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的方法，其特征在于，步驟(3)中將步驟(2)的兩種
擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增；所采用的引物序列如SEQ ID NO.78-79所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的非診斷目的的方法，其特征在于，步驟(3)中PCR反應(yīng)程
序?yàn)椋?8℃預(yù)變性45s；98℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15個(gè)循環(huán)；72℃終延伸
60s；4℃保持。
7.一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的系統(tǒng)，包括以下操作單元：
(1)血漿cfDNA提取單元；
(2)BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增單元；所述單元(2)中BCR H鏈
全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條，序列分別如SEQ ID NO.1-22所示，下游引物共6
條，序列分別如SEQ ID NO.23-28所示；
TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條，序列分別如SEQ ID NO.29-73所示，
下游引物共4條，序列分別如SEQ ID NO.74-77所示；
(3)步驟(2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增單元；單元(3)中是將單元(2)
的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增；所采用的引物序列如SEQ ID NO.78-79
所示；
(4)高通量測(cè)序單元；
(5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析單元，單元(5)的免疫組庫精準(zhǔn)信息分析包括以下步驟：
1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置，7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成4⁷種唯一標(biāo)簽，
將成對(duì)測(cè)序序列的測(cè)序序列1和測(cè)序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連，形成14bp的一條索
引，并且以這14bp作為的成對(duì)測(cè)序序列索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將來源于同一個(gè)DNA模板
的所有測(cè)序序列聚集到一起的目的；
2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測(cè)序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢明距
離，將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇，每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測(cè)序序列的漢
明距離不超過3，以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測(cè)序序列的目的；
3)對(duì)于每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段中的測(cè)序序列的每一個(gè)測(cè)序堿基進(jìn)行互
相比對(duì)，若某種堿基型在測(cè)序序列中的一致率達(dá)到80％，則記新測(cè)序序列的這個(gè)堿基為此
堿基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測(cè)序序列，通過這種方法矯
正，可以有效去除測(cè)序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；
4)對(duì)新測(cè)序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測(cè)序序列；
5)根據(jù)4)中得到的測(cè)序序列與IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行
比對(duì)注釋，同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記，對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì)定量；
6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行其他相關(guān)分析。
8.權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在非診斷目的的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-6任一所述的方法或權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在制備疾病篩查試劑盒中的
應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疾病為腫瘤、自身免疫性疾病、感染
性疾病。
11.權(quán)利要求1-6任一所述的方法或權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在制備評(píng)價(jià)免疫系統(tǒng)功能試
劑盒中的應(yīng)用。