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一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法

  • 專利類型:發(fā)明專利
  • 有效期:不限
  • 發(fā)布日期:2021-09-27
  • 技術(shù)成熟度:可以量產(chǎn)
交易價(jià)格: ¥面議
  • 法律狀態(tài)核實(shí)
  • 簽署交易協(xié)議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(shù)(專利)類型 發(fā)明專利
  • 申請(qǐng)?zhí)?專利號(hào) CN201510488029.3 
  • 技術(shù)(專利)名稱 一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法 
  • 項(xiàng)目單位 北京吉因加科技有限公司
  • 發(fā)明人 易鑫,呂小星,趙美茹,管彥芳,劉濤,楊玲 
  • 行業(yè)類別 藥品-化學(xué)藥品
  • 技術(shù)成熟度 可以量產(chǎn)
  • 交易價(jià)格 ¥面議
  • 聯(lián)系人 許名生
  • 發(fā)布時(shí)間 2021-09-27  
  • 01

    項(xiàng)目簡(jiǎn)介

    本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法,包括以下步驟:血漿cfDNA提取、BCR H鏈的全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增、兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序、免疫組庫精準(zhǔn)信息分析。上述三次PCR擴(kuò)增的引物分別如SEQ ID NO.1?28、SEQ ID NO.29?77、SEQ ID NO.78?79所示。本發(fā)明還提供了含有上述引物的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR的試劑盒。本發(fā)明方法以及試劑盒能夠同時(shí)檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)信息分析和免疫組庫各亞克隆的精確定量,在無創(chuàng)檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種非診斷目的的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法,包括以下步驟:
    (1)血漿cfDNA提取;
    (2)BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增;
    步驟(2)中BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條,序列分別如SEQ ID
    NO.1-22所示,下游引物共6條,序列分別如SEQ ID NO.23-28所示;
    TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條,序列分別如SEQ ID NO.29-73所示,
    下游引物共4條,序列分別如SEQ ID NO.74-77所示;
    (3)步驟(2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增;其中,步驟(3)所述的兩種擴(kuò)
    增產(chǎn)物分別是指BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中片段大小在300-350bp的片段回收純化后
    的產(chǎn)物、以及TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中片段大小在200-250bp的片段回收純化后的產(chǎn)
    物;
    (4)高通量測(cè)序;
    (5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析,包括以下步驟:
    1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置,7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成47種唯一標(biāo)簽,
    將成對(duì)測(cè)序序列的測(cè)序序列1和測(cè)序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連,形成14bp的一條索
    引,并且以這14bp作為的成對(duì)測(cè)序序列索引進(jìn)行外部排序,以達(dá)到將來源于同一個(gè)DNA模板
    的所有測(cè)序序列聚集到一起的目的;
    2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測(cè)序序列進(jìn)行中心聚類,根據(jù)插入序列之間的漢明距
    離,將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇,每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測(cè)序序列的漢
    明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測(cè)序序列的目的;
    3)對(duì)于每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段中的測(cè)序序列的每一個(gè)測(cè)序堿基進(jìn)行互
    相比對(duì),若某種堿基型在測(cè)序序列中的一致率達(dá)到80%,則記新測(cè)序序列的這個(gè)堿基為此
    堿基型,否則記為N,這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測(cè)序序列,通過這種方法矯
    正,可以有效去除測(cè)序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性;
    4)對(duì)新測(cè)序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾,去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測(cè)序序列;
    5)根據(jù)4)中得到的測(cè)序序列與IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行
    比對(duì)注釋,同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記,對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì)定量;
    6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析,免疫組庫表達(dá)譜分析、Biomarker分析。
    2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的方法,其特征在于,步驟(2)中,各條上游引物的
    濃度相同,各條下游引物的濃度相同,且下游單個(gè)引物濃度為上游單個(gè)引物濃度的20倍。
    3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的方法,其特征在于,步驟(2)中BCR H鏈全長(zhǎng)多重
    PCR擴(kuò)增條件為:98℃預(yù)變性45s;98℃變性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共8個(gè)循環(huán);72
    ℃終延伸60s;4℃保持。
    4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的方法,其特征在于,步驟(2)中TCRβ鏈CDR3多重
    PCR擴(kuò)增條件為:98℃預(yù)變性45s;98℃變性15s,54℃退火30s,72℃延伸30s,共8個(gè)循環(huán);72
    ℃終延伸60s;4℃保持。
    5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的方法,其特征在于,步驟(3)中將步驟(2)的兩種
    擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增;所采用的引物序列如SEQ ID NO.78-79所示。
    6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的非診斷目的的方法,其特征在于,步驟(3)中PCR反應(yīng)程
    序?yàn)椋?8℃預(yù)變性45s;98℃變性15s,65℃退火30s,72℃延伸30s,共15個(gè)循環(huán);72℃終延伸
    60s;4℃保持。
    7.一種檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的系統(tǒng),包括以下操作單元:
    (1)血漿cfDNA提取單元;
    (2)BCR H鏈全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增和TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增單元;所述單元(2)中BCR H鏈
    全長(zhǎng)多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條,序列分別如SEQ ID NO.1-22所示,下游引物共6
    條,序列分別如SEQ ID NO.23-28所示;
    TCRβ鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條,序列分別如SEQ ID NO.29-73所示,
    下游引物共4條,序列分別如SEQ ID NO.74-77所示;
    (3)步驟(2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增單元;單元(3)中是將單元(2)
    的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增;所采用的引物序列如SEQ ID NO.78-79
    所示;
    (4)高通量測(cè)序單元;
    (5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析單元,單元(5)的免疫組庫精準(zhǔn)信息分析包括以下步驟:
    1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置,7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成47種唯一標(biāo)簽,
    將成對(duì)測(cè)序序列的測(cè)序序列1和測(cè)序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連,形成14bp的一條索
    引,并且以這14bp作為的成對(duì)測(cè)序序列索引進(jìn)行外部排序,以達(dá)到將來源于同一個(gè)DNA模板
    的所有測(cè)序序列聚集到一起的目的;
    2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測(cè)序序列進(jìn)行中心聚類,根據(jù)插入序列之間的漢明距
    離,將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇,每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測(cè)序序列的漢
    明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測(cè)序序列的目的;
    3)對(duì)于每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段中的測(cè)序序列的每一個(gè)測(cè)序堿基進(jìn)行互
    相比對(duì),若某種堿基型在測(cè)序序列中的一致率達(dá)到80%,則記新測(cè)序序列的這個(gè)堿基為此
    堿基型,否則記為N,這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測(cè)序序列,通過這種方法矯
    正,可以有效去除測(cè)序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性;
    4)對(duì)新測(cè)序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾,去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測(cè)序序列;
    5)根據(jù)4)中得到的測(cè)序序列與IMGT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考序列進(jìn)行
    比對(duì)注釋,同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記,對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì)定量;
    6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行其他相關(guān)分析。
    8.權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在非診斷目的的檢測(cè)血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的應(yīng)用。
    9.權(quán)利要求1-6任一所述的方法或權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在制備疾病篩查試劑盒中的
    應(yīng)用。
    10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的疾病為腫瘤、自身免疫性疾病、感染
    性疾病。
    11.權(quán)利要求1-6任一所述的方法或權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)在制備評(píng)價(jià)免疫系統(tǒng)功能試
    劑盒中的應(yīng)用。
    展開

專利技術(shù)附圖

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    專利證書

    專利利登記簿副本

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