本發(fā)明涉及定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基及方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明研發(fā)了一種體外大鼠胚胎干細(xì)胞定向心肌細(xì)胞高效分化培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)小鼠來源的層粘連蛋白(laminin)共同構(gòu)成大鼠胚胎干細(xì)胞體外定向心肌細(xì)胞高效分化系統(tǒng)，可以更好的促使大鼠擬胚體(rat embryonic body，rEB)貼附，增殖，定向心肌細(xì)胞分化。本發(fā)明體系體現(xiàn)為分化效率高，分化周期短，分化產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)目多等特點(diǎn)。

1.使用培養(yǎng)體系定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)體系包括以下培養(yǎng)基：N2B27培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：DMEM/F12-N2培養(yǎng)基 20mlNeurobasal/B27 培養(yǎng)基 20mlDPBS配制的55mM β-巰基乙醇 72μl青霉素-鏈霉素 10000U/ml，10000μg/ml 0.4ml，CM-feeder培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：胎牛血清10ml100X非必須氨基酸0.5mlDMEM/F12培養(yǎng)基 38.5ml55mM β-巰基乙醇90μl200mM L-谷氨酰胺0.5ml，青霉素-鏈霉素 10000U/ml，10000μg/ml 0.5ml，將此培養(yǎng)基按每孔2ml的量加入到提前鋪有生長(zhǎng)密度為80-90%的胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)24小時(shí)，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液既為CM-feeder培養(yǎng)基；CM培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：CM-feeder培養(yǎng)基 20mlN2B27培養(yǎng)基 20ml懸滴培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：CM培養(yǎng)基 40ml50mM Y27632 8μl10mM PD0325901 0.4μl10mM CHIR-99021 3μlCM+2i培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：CM培養(yǎng)基 40ml10mM PD0325901 0.4μl10mM CHIR-99021 3μlCM高效分化培養(yǎng)基，采用以下組分配制而成：IMDM培養(yǎng)基 40ml200mM L-谷氨酰胺 0.5ml胎牛血清 7.52ml1-硫代甘油 0.52μl由H₂O配制的5mg/ml L-抗壞血酸 0.5ml青霉素-鏈霉素 10000U/ml，10000μg/ml 0.5ml，定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法包括以下步驟：1） 大鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)到60%-80% 密度，使用槍頭吹打細(xì)胞，將吹下的細(xì)胞使用胰蛋白酶消化為單細(xì)胞；2） 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將大鼠胚胎干細(xì)胞濃度調(diào)為1.5×10⁵/ml-2.5×10⁵/ml，以18μl-22μl每滴進(jìn)行懸滴，此時(shí)大鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基為懸滴培養(yǎng)基，懸滴2天；3） 使用CM+2i培養(yǎng)基將小鼠源性層粘連蛋白進(jìn)行50倍稀釋，提前4小時(shí)將層粘連蛋白稀釋液鋪于待培養(yǎng)分化細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)，4小時(shí)后吸干層粘連蛋白稀釋液，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入CM+2i培養(yǎng)基，然后將已懸滴2天的大鼠擬胚體吸入培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)；4）24小時(shí)后大鼠擬胚體已貼壁，此時(shí)將CM+2i培養(yǎng)基更換為CM高效分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，將層粘連蛋白稀釋液鋪于待培養(yǎng)分化細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)時(shí)，確保層粘連蛋白稀釋液完全覆蓋培養(yǎng)皿。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述DMEM/F12-N2培養(yǎng)基包括DMEM/F12培養(yǎng)基與N-2添加劑，其中，DMEM/F12培養(yǎng)基與N-2添加劑體積比為100:1；所述Neurobasal/B27 培養(yǎng)基包括Neurobasal培養(yǎng)基、B-27無血清補(bǔ)充劑及L-谷氨酰胺，其中Neurobasal培養(yǎng)基、B-27無血清補(bǔ)充劑及L-谷氨酰胺的體積比為40:0.8:0.2。