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一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-10-28
  • 技術成熟度:可以量產
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201710654622.X 
  • 技術(專利)名稱 一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法 
  • 項目單位 北京再生生物科技研究院有限公司
  • 發明人 張洪鈿,苑春慧 
  • 行業類別 藥品-化學藥品
  • 技術成熟度 可以量產
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 鄭秩蕓
  • 發布時間 2021-10-28  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,包括如下步驟:S1.以新生兒臍帶華通氏膠經MSCs培養基培養得到P2代臍帶MSCs;S2.以MSCs培養基懸浮P2代臍帶MSCs,接種至重組人層黏連蛋白和重組人玻連蛋白包被的細胞培養板中培養至60?70%匯合,換神經分化培養基制備得到神經上皮預誘導細胞;S3.以神經上皮預誘導細胞經OPCs培養基培養得到P0代OPCs,并傳代培養至P2代;S4.以P2代OPCs制備OPCs滋養層;S5.制備DRG感覺神經元細胞,以OPCs滋養層與DRG感覺神經元細胞進行共培養。本發明提出的MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,為中樞神經系統神經損傷修復的細胞治療提供了新的思路。
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  • 02

    說明書

    1.一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,包括如下步驟:S1.以新生兒臍帶華通氏膠經MSCs培養基培養得到P2代臍帶MSCs;S2.以MSCs培養基懸浮P2代臍帶MSCs,接種至重組人層黏連蛋白和重組人玻連蛋白包被的細胞培養板中培養至60-70%匯合,換神經分化培養基制備得到神經上皮預誘導細胞;S3.以神經上皮預誘導細胞經OPCs培養基培養得到P0代OPCs,并傳代培養至P2代;S4.以P2代OPCs制備OPCs滋養層;S5.制備DRG感覺神經元細胞,以OPCs滋養層與DRG感覺神經元細胞進行共培養;所述MSCs培養基為含2%血清替代物的無血清培養基;所述神經分化培養基為包含以下成分的DMEM/F12:1×B27,1×N2,1uM 1,25-二羥維生素D3,40ng/mL三碘甲狀腺氨酸,0.5ug/mL人褪黑素,20ng/mL重組人堿性成纖維細胞生長因子,20ng/mL重組人表皮生長因子;所述OPCs培養基為包含以下成分的DMEM/F12:1×B27,1×N2,2mM L-谷氨酰胺,1uM 1,25-二羥維生素D3,40ng/mL三碘甲狀腺氨酸,0.5ug/mL人褪黑素,20ng/mL重組人堿性成纖維細胞生長因子,20ng/mL重組人表皮生長因子,20ng/mL重組人血小板來源生長因子AA,4ng/mL重組人神經營養因子3。2.根據權利要求1所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述步驟S1進一步包括如下步驟:足月健康新生兒臍帶經洗滌,無菌解剖剝離華通氏膠,剪碎,以MSCs培養基懸浮后,轉移至培養瓶置于CO2培養箱內培養,培養至第14天時,加入消化液室溫消化5分鐘后終止,離心棄上清,收獲沉淀物以尼龍細胞篩過濾,收集濾液,離心棄上清,收獲沉淀物,記為P0代臍帶MSCs;以MSCs培養基重懸細胞,調整細胞密度,接種至新的組織培養瓶中培養至第4天,收獲,記為P1代臍帶MSCs,將P1代繼續培養至P2代。3.根據權利要求1所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述步驟S2進一步包括如下步驟:以MSCs培養基懸浮P2代臍帶MSCs,接種至重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白包被的培養板中,培養至60-70%匯合,換神經分化培養基,37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養4天,吸棄培養上清,PBS洗滌培養表面1次,加入胰蛋白酶溶液,室溫消化5分鐘后終止,離心棄上清,收獲沉淀細胞,即為神經上皮預誘導細胞。4.根據權利要求1所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述步驟S3進一步包括如下步驟:以OPCs培養基重懸神經上皮預誘導細胞,接種至重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白包被的培養板中,隔天換液,60-80%匯合時,吸棄培養上清,PBS洗滌培養表面,加入AccutaseTM消化液,室溫消化5分鐘后終止,離心棄上清,收獲沉淀細胞,記為P0代OPCs,P0代OPCs傳代培養至P2代時收獲。5.根據權利要求4所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述P0代OPCs傳代培養的培養體系為:經OPCs培養基懸浮,接種至重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白包被的組織培養瓶。6.根據權利要求1所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述步驟S4進一步包括如下步驟:以OPCs培養基重懸P2代OPCs,接種至重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白包被的培養板中,培養至24小時,換含3%FBS的DMEM/F12培養48小時備用,此為OPCs滋養層。7.根據權利要求1所述的一種MSCs來源的OPCs滋養感覺神經元軸突生長的方法,其特征在于,所述步驟5進一步包括如下步驟:斷頸處死成年雄性Wistar大鼠,手術取DRG,以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG,600g離心10分鐘,棄上清;以胰蛋白酶溶液重懸沉淀,37℃消化15分鐘后終止,離心棄上清;沉淀以生理鹽水洗滌,以移液管抽吸吹打,離心棄上清,沉淀為DRG感覺神經元細胞;以含3%FBS的DMEM/F12重懸DRG感覺神經元細胞,調整細胞密度;吸棄OPCs滋養層培養基,再接種DRG感覺神經元細胞懸液,37℃,5%CO2條件下共培養48小時。
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