本發(fā)明公開了一種以花瓣為外植體建立藍(lán)晶花小鱗莖再生體系的方法，該方法包括：取藍(lán)晶花花蕾，消毒處理后，切取花瓣，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得含小鱗莖的愈傷組織；將小鱗莖從愈傷組織中剝離下來，并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得小鱗莖增殖體；取所述小鱗莖增殖體，接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行小鱗莖的膨大和生根誘導(dǎo)，獲得藍(lán)晶花小鱗莖。本發(fā)明以花瓣為外植體，通過消毒處理、誘導(dǎo)愈傷、小鱗莖再生和增殖以及小鱗莖膨大和生根培養(yǎng)，獲得藍(lán)晶花小鱗莖再生體系；顯著降低了污染率，提高了誘導(dǎo)率和增殖效率，縮短了擴(kuò)繁周期。

1.一種以花瓣為外植體建立藍(lán)晶花小鱗莖再生體系的方法，其特征在于，包括以下步
驟：
(1)外植體取材及處理
于藍(lán)晶花花期6月，采長1.5～2.5cm花苞未打開的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4℃冰箱
中冷藏1周；
將冷藏后的花蕾材料轉(zhuǎn)移至燒杯中，在滴加了少許吐溫及洗潔精的水中浸泡20min，隨
后將紗布覆蓋于燒杯口，隔紗布用流水沖洗1.5h；將沖洗后的外植體置于75％的乙醇中浸
泡30s，再置于0.1％升汞中浸泡處理10min，浸泡過程中不斷搖晃使外植體與消毒試劑充分
接觸；再用無菌水漂洗5遍，每遍不少于3分鐘，直至無明顯泡沫出現(xiàn)；用鑷子取出外植體，置
于無菌操作臺上，用濾紙吸干表面水分，待接種；
(2)外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo)
于超凈工作臺上，用滅菌鑷子和解剖刀將步驟(1)消毒處理后的幼嫩花蕾剝離開，切取
花瓣，將其平鋪接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，花瓣基部傷口處輕插入培養(yǎng)基中；在培養(yǎng)溫度為
25±2℃的全黑暗誘導(dǎo)條件下60d開始出現(xiàn)愈傷組織；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基
本培養(yǎng)基，即每升培養(yǎng)基添加4.43gMS粉，所述培養(yǎng)基中還含有30g/L的蔗糖，8g/L瓊脂，
0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤，2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，pH值為5.8；
(3)小鱗莖再生
將花瓣外植體連同愈傷組織團(tuán)塊一起于超凈工作臺上轉(zhuǎn)接到新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，
進(jìn)行90d的小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，每30d繼代一次，至小鱗莖直徑達(dá)0.4～0.5cm；培養(yǎng)環(huán)境的光照
強(qiáng)度為12.5μmol·m^-2·s^-1，光照時間14h·d^-1，溫度為25±2℃；
(4)小鱗莖增殖
將分化形成的小鱗莖從愈傷組織團(tuán)塊上分離下來，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，每4周繼代一次，
以維持小鱗莖持續(xù)增殖；在光照強(qiáng)度為12.5μmol·m^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為25±
2℃的條件下進(jìn)行90d的小鱗莖增殖培養(yǎng)，獲得小鱗莖增殖比率為1:25；
所述增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，即每升繼代培養(yǎng)基中添加4.43gMS粉，增殖
培養(yǎng)基中還含有30g/L的蔗糖、8g/L瓊脂、2.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.5mg/Lα-萘乙酸，增
殖培養(yǎng)基的pH值為5.9；
(5)小鱗莖膨大及生根培養(yǎng)：
用滅菌的鑷子和解剖刀將經(jīng)由增殖培養(yǎng)得到的小鱗莖叢剝落分離成單獨(dú)的小鱗莖個
體，基盤向下輕插入培養(yǎng)基中，進(jìn)行小鱗莖的膨大及生根誘導(dǎo)；在光照強(qiáng)度為12.5μmol·m
^-2·s^-1、光照時間14h·d^-1，溫度為25±2℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)90d，可獲得藍(lán)晶花小鱗莖；
所述膨大及生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，即每升培養(yǎng)基中添加有4.43g MS
粉，膨大培養(yǎng)基中還含有濃度為2.0mg/L的α-萘乙酸、90g/L的蔗糖、8g/L的瓊脂；pH值為
5.9。