1.一種肝素黃桿菌肝素酶Ⅱ的制備方法，所述方法包括下述步驟：（1）肝素酶粗酶液的制備：?將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23℃、150rpm培養(yǎng)1天，然后按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23℃、150rpm培養(yǎng)2-3天，菌液10000rpm、4℃離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在25mM?Tris-HCl緩沖液中，冰浴中以功率150W、超聲5s暫停5s的模式超聲，4℃、10000rpm離心30min，上清即為粗酶液；?（2）硫酸銨沉淀除雜質：冰浴中向粗酶加入等體積的溶于10-25mM?Tris-HCl?緩沖液的飽和硫酸銨溶液，緩慢滴加，加完后冰浴中緩慢攪拌沉淀30min，然后18000rpm離心30min，取上清，冰浴中向其中再緩慢加入干燥的硫酸銨粉末至飽和度70%，攪拌30min，然后18000rpm離心30min，棄上清，將沉淀以25mM?Tris-HCl緩沖液適量溶解，裝入截留分子量10KD透析袋中對100倍體積上述緩沖液過夜透析，得去除雜質后的酶液；（3）肝素酶Ⅱ的SP柱分離：將步驟（1）所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的洗脫液，收集液各管隨洗脫的進行呈兩個分離完全的活性峰靠前的那個為肝素酶Ⅱ，靠后的那個為肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ的混合物；（4）肝素酶Ⅱ的肝素親和層析純化：步驟（3）肝素酶Ⅱ活性峰洗脫液透析后上一根用5-10mM?Tris-HCl緩沖液平衡過的HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.1M洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析；（5）肝素酶Ⅱ的CS（Cellufine?Sulfate）柱純化：步驟（4）得到的酶液上一根用10-50mMTris-HCl緩沖液平衡過的Cellufine?Sulfate柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1.5M洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析；（6）肝素酶Ⅱ的SP-HPLC純化：步驟（5）得到的酶液上一根用10mM?Tris-HCl緩沖液平衡過的SP-HPLC柱，以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度0-1.0M洗脫，收集測得有酶活性的洗脫液若干管，合并、透析，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶Ⅱ；其中，步驟（1）所述的種子培養(yǎng)基的組成為：牛肉膏5?g/L，蛋白胨10?g/L?，酵母粉?5?g/L，NaCl為5?g/L，pH7.0；步驟（1）所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：肝素8g/L,?K2HPO4?2.5?g/L,?NaH2PO4?2.5?g/L,?NH4Cl?2.0?g/L,?MgCl2?0.5?g/L,?組氨酸?0.5?g/L,?甲硫氨酸?0.5?g/L,?微量元素NaMoO3、?CuCl2、?FeCl2、CoCl2、MnCl2、?CaCl2各1×10-4M；步驟（1）、（2）、（3）、（5）、（6）所述Tris-HCl緩沖液均含10mM?CaCl2、pH6.5-8.0。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3）所用SP層析柱的填料優(yōu)選使用SP-sepharose?FF填料，也可使用其他以SP為分離功能基團的蛋白純化填料或離子交換樹脂。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（4）所用肝素親和層析柱的填料優(yōu)選使用鍵合了肝素的Sepharose?4B，也可使用其他鍵合了肝素的蛋白純化填料或離子交換樹脂。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（4）所述Tris-HCl緩沖液為Tris-HCl溶液，pH6.5-8.0。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（5）所用Cellufine?Sulfate層析柱的填料優(yōu)選使用CHISSO公司的親和層析填料Cellufine?Sulfate，也可使用其它公司同類的親和填料。6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（6）所用HPLC設備可為任何一種有一定制備能力的HPLC設備，其SP-HPLC層析柱優(yōu)選使用Waters公司的Protein-Pak?SP?HPLC柱,?填料規(guī)格為8HR、1000?、8μm，也可使用其他以SP為分離功能基團的HPLC柱子。
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