本發(fā)明提供了一種肝素黃桿菌軟骨素酶B和軟骨素酶AC的制備方法，以肝素黃桿菌為原料，將肝素黃桿菌接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)、再接到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵、離心收集沉淀、沉淀超聲破碎、離心得到肝素黃桿菌軟骨素酶B和軟骨素酶AC的粗酶液，先將粗酶液通過一次硫酸銨沉淀去除部分雜質(zhì)，然后通過OCTYL-Sepharose FF層析分離為酶B和酶AC兩部分，再將酶B和酶AC分別各過三次SP-Sepharose FF純化，得到高純度的軟骨素酶B和軟骨素酶AC。

1.一種肝素黃桿菌軟骨素酶的制備方法，所述方法包括下述步驟：
(1)肝素黃桿菌的發(fā)酵：
將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23
℃，150rpm，培養(yǎng)1天；然后按5％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23℃，15
0rpm，培養(yǎng)2-3天；菌液10000rpm，4℃離心15-30分鐘，收集沉淀，懸
浮在100ml、50mM?Tris-HCl^①緩沖液中，冰浴超聲1小時(shí)，4℃，1000
0rpm，離心30min，上清即為粗酶液；
(2)粗酶液的硫酸銨沉淀法粗純化：
向粗酶液中加硫酸銨至45％飽和度，4℃沉淀1小時(shí)，10000rpm，離心
30min，向上清繼續(xù)加硫酸銨至65％飽和度，4℃沉淀1小時(shí)，10000rp
m，離心30min，取沉淀溶于含硫酸銨45％飽和度的Tris-HCl^①緩沖液；
得粗純化液；
(3)粗純化液的OCTYL柱分離：
將步驟(2)所得粗純化液上一根用含硫酸銨45％飽和度的Tris-HCl^①緩
沖液平衡過的OCTYL柱，以同樣緩沖液平衡3個(gè)柱體積，然后以緩沖液
中含硫酸銨線形梯度45％-0飽和度，分別收集洗脫液中具有軟骨素酶
B活性和軟骨素酶AC活性的洗脫液，該兩個(gè)洗脫液呈兩個(gè)活性峰I、II
；
(4)軟骨素酶B的純化：
步驟(3)活性峰I的洗脫液透析后上一根用50mM?Tris-HCl^①緩沖液平衡
過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個(gè)柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖
液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性
的組分，透析后上一根用Tris-HCl^①緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖
液平衡3個(gè)柱體積，Tris-HCl^③緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫
，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM?Tris-HCl
^②緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個(gè)柱體積，以同樣濃度的
Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有
肝素酶活性的組分，以截留分子量10kd的超濾離
心管濃縮，得到軟骨素酶B；
(5)軟骨素酶AC的純化：
活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM?Tris-HCl^①緩沖液平衡過的SP柱
，以同樣緩沖液平衡3個(gè)柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯
化鈉線形梯?度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶AC活性的組
分，透析后上一根用Tris-HCl^④緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平
衡3個(gè)柱體積，Tris-HCl^④緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收
集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM?Tris-HCl^②緩沖
液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個(gè)柱體積，以同樣濃度的Tris-
HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙
酰肝素酶活性的組分以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，得到軟骨
素酶AC；
在上述步驟中，所述Tris-HCl^①緩沖液含10mM?CaCl₂、pH6.5-8.0；
所述Tris-HCl^②緩沖液含10mM?CaCl₂、pH6.5-8.0；
所述Tris-HCl^③緩沖液含氯化鈉5-75mM、含肝素0.01-0.5％，肝素的種
類為高純度肝素；
所述Tris-HCl^④緩沖液含氯化鈉5-75mM、含硫酸皮膚素0.01-0.5％，硫
酸皮膚素的種類為高純度硫酸皮膚素。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述種子培
養(yǎng)基的組成為牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl為0.5％
、pH7.0。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述發(fā)酵培
養(yǎng)基組成為硫酸皮膚素8?g/L，K₂HPO₄?2.5?g/L，NaH₂PO₄?2.5?
g/L，NH₄Cl?2.0?g/L，MgCl₂?0.5?g/L，組氨酸0.5?g/L，甲硫氨
酸0.5?g/L，微量元素NaMoO₃、CuCl₂、FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、CaCl
₂各1×10^-4M。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在Tris-HCl^③緩沖液中，
氯化鈉的含量范圍為25-45mM，高純度肝素的含量為0.1-0.2%。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在Tris-HCl^④緩沖液中，
氯化鈉的含
量范圍為25-45mM，硫酸皮膚素的含量為0.01-0.1%。