本發明公開了一種千層塔發狀根系的制備與培養方法，屬生物細胞工程技術。該方法取千層塔幼嫩莖為外植體進行脫分化處理，獲得新鮮千層塔愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質粒的發根農桿菌(DL1968)共培養，以無菌紙吸取多余菌液后轉入到誘導培養基中誘導培養，在千層塔愈傷組織處生長出千層塔發狀根；抑菌培養后將具有發狀根的外植體放入擴增培養基中進行發狀根的擴大培養。本發明利用生物細胞工程技術建立千層塔發狀根系培養系統，制備千層塔發狀根系，實現了標準化生產千層塔，替代野生資源，緩解了千層塔日益增長的市場需求，而且解決了千層塔依賴進口問題。對藥用植物發狀根的工業化和商業化開發具有重要意義。

1.一種千層塔發狀根系的制備與培養方法，其特征在于，
該方法通過如下步驟實現：
(1)將千層塔幼嫩莖剪成1～5cm的小段，無菌操作臺中用HgCl₂處理6～13min，酒精
浸泡5～10s，無菌水沖洗3～8遍后轉入到B₅+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培養基中，26℃±1
下
暗培養12-20d，獲得千層塔愈傷組織；
(2)將發根農桿菌ACCC10060菌株用1μL無菌水稀釋后，涂布在20mL?YEB固體培養基
上，25℃±1下培養2～4d，長出克隆菌體;
(3)挑取由步驟(2)獲得的克隆菌體的單菌落接種于50mL液體YEB培養基中，25℃±3
振蕩培養，培養12小時，OD值為0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液體培養
基中振蕩培養，培養8h，OD值為0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下離心5～15分鐘收集菌
體；
(4)將步驟(3)收集的菌體置于100ml含有100μmol/L乙酰丁香酮的B₅液體培養基中并混
勻；
(5)用步驟(4)混勻后得到的菌液浸染千層塔愈傷組織10～30min，取出后用無菌紙
吸取多余的菌液，將浸染的千層塔愈傷組織接入到含有100μmol/L乙酰丁香酮、0.7％瓊脂
的B₅固體培養基中1-2d；
(6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素B5固體培養基作為誘導培養基，將步驟(5)
浸染后的愈傷組織接入該誘導培養基中，進行抑菌繼代培養；25℃±1黑暗培養，每3～9d
繼代培養一次，至少五次的抑菌培養處理，直至將菌除凈；
(7)用無激素B5液體培養基作為擴增培養基，將抑菌處理后1g的誘導出來的發狀根放
入50mL的擴增培養基中，25℃±1黑暗懸浮振蕩培養，振蕩搖床轉速為100～110r·min^-1。