1.一種同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產物的檢測方法，所述的五種
CYP450酶是CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19；主要有以下
三個步驟：
(1)肝微粒體的制備及孵化：
首先制備大鼠肝微粒體；分別選擇非那西丁、咪達唑侖、異喹胍、甲苯磺
丁脲和美芬妥英作為五種CYP450酶的探針藥物，分別建立五種探針藥物孵化體
系；將肝微粒體分別與五種探針藥物進行孵化反應，使這五種探針藥物在其特異
性酶的作用下分別轉化成對乙酰氨基酚、4’-羥基異喹胍、1’-羥基咪達唑侖、4’-
羥基甲苯磺丁脲和4’-羥基美芬妥英；
(2)樣品預處理：樣品預處理按下述步驟操作，
①孵化反應終止后，取反應液，立即加入冰冷甲醇；
②取5只玻璃試管，分別加入內標溶液，再分別加入5種①的探針藥孵化液；
所述的內標溶液是，以體積比為1∶1的甲醇和水作溶劑，含500ng/mL褪黑素
和100ng/mL克倫特羅的甲醇-水溶液；
③再加入體積比為1∶1的甲醇水溶液和蒸餾水，振搖；
④再加入體積比為乙酸乙酯∶異丙醇＝95∶5的溶液，渦流，振蕩，離心；
⑤分離④中上清液于干凈10mL玻璃試管中，氮氣下吹干；
⑥將⑤中的得到的殘留物用流動相溶解；
(3)探針藥物代謝產物的測定：探針藥物代謝產物測定的條件是：
①色譜條件：Agilent?1100高效液相色譜輸液泵，Agilent?1100自動進樣器；
色譜柱：Zorbax?SB-Aq柱，150mm×4.6mm?I.D.，5μm粒徑；流動相：含0.1％
甲酸的乙腈和含0.1％甲酸的水，梯度洗脫，見表1；柱溫40℃；流速1.0mL/min；
表1梯度洗脫程序
??時間(min)
??0.00
??0.50
??3.00
??4.50
??5.00
??6.00
??8.00
??水(v％)
??80
??80
??20
??10
??10
??80
??80
??乙腈(v％)
??20
??20
??80
??90
??90
??20
??20
②質譜條件：API4000型三重四極桿串聯質譜儀，配有離子噴霧離子源以及
Analyst?1.3數據處理系統；離子噴射電壓為5000V；溫度為500℃；源內氣體1：
N
2為60p.s.i.，氣體2：N
2為65p.s.i.，氣簾氣體：N
2為20p.s.i.；檢測方式：正
離子檢測；掃描方式：選擇反應監測方式，用于定量分析的離子反應分別為：對
乙酰氨基酚m/z?152.3→m/z?110.2，4’-羥基異喹胍m/z?192.0→m/z?132.1，1’-羥
基咪達唑侖m/z?342.3→m/z?203.2，4’-羥基甲苯磺丁脲m/z?287.4→m/z?171.1，
4’-羥基美芬妥英m/z?235.4→m/z?150.0，內標褪黑素m/z?233.2→m/z?174.1，內
標，克倫特羅m/z?277.2→m/z?203.1；DP電壓分別為53V、35V、70V、36V、
50V、37V、50V；CE分別為22eV、26eV、36eV、24eV、26eV、19eV，22eV。
2.根據權利要求1所述的同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產物的檢測
方法，其特征在于，所述的步驟(1)的肝微粒體的孵化，孵化體系的組成為：
大鼠肝微粒體蛋白1.0mg/mL、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸1.0mmol/L、MgCl
210.0mmol/L、KCl?10.0mmol/L、和用體積比甲醇∶水＝1∶1配制的探針藥物；
以pH?7.4的0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液定容至500μL，孵化體系中甲醇的終
濃度≤0.01％。
3.根據權利要求1所述的同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產物的檢測
方法，其特征在于，所述的步驟(2)樣品預處理中，
步驟①為：孵化反應30min后，取反應液100μL，立即加入100μL冰冷甲
醇；
步驟②為：取5只10mL玻璃試管，分別加入100μL的內標溶液，再分別
加入5種探針藥的①孵化液各100μL；
步驟③為：加50μL甲醇水溶液和200μL蒸餾水，振搖20下；
步驟④為：加入3mL乙酸乙酯∶異丙醇＝95∶5的溶液，渦流2min，振蕩
10min，3500rpm下離心5min；
步驟⑤為：分離④中上清液在40℃氮氣下吹干；
步驟⑥為：將⑤中的得到的殘留物用150μL流動相溶解，取30μL用于測
定。
