本發(fā)明涉及一類基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針、制備方法及其應(yīng)用，以熒光素衍生物作為起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈等作為輔助熒光單元，以丙烯?；?、2,4?二硝基苯磺?；茸鳛樯飿酥疚镯憫?yīng)單元。通過引入輔助熒光單元，實現(xiàn)了對該類熒光探針吸收波長及雙通道熒光發(fā)射波長的調(diào)控：吸收波長為400nm?750nm；雙通道熒光發(fā)射，通道一發(fā)射波長為520nm，通道二發(fā)射波長為517nm?720nm。針對不同生物標志物的檢測，通過連接不同的識別基團，實現(xiàn)了對通道一熒光強度調(diào)控：探針與生物標志物響應(yīng)后，通道一熒光強度顯著增強；通道二熒光強度保持不變，實現(xiàn)了內(nèi)標比率型熒光探針對生物標志物的定量檢測。

1.一種基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其為式Ⅰ所示化合物： A為O,S或Si；B為O,S或N-R₁；R₁選自H,NH₂,C₁～C₄的烴基或苯基；C為O、或式Ⅱ所示基團：丙二腈(Ⅱ-1)或三氰基化合物(Ⅱ-2)或多元取代雜環(huán)(Ⅱ-3,4,5)； 其中所述式Ⅱ中，式Ⅱ-2中：R₂選自苯基；式Ⅱ-3中：R₃選自O(shè)或N-R₁₂,R₁₂選自C₁～C₄的直鏈烷基；R₄與R₅的組合為苯基；式Ⅱ-4中：R₆與R₇的組合為苯基或式Ⅴ；R₈選自C₁～C₄的直鏈烷基；式Ⅱ-5中：R₉選自H,C₁～C₃的直鏈烷基；R₁₀、R₁₁選自苯基或F； D為O-R₁₃,NH-R₁₄,R₁₃,R₁₄分別獨立選自H，或式Ⅲ-1A,Ⅲ-1B,Ⅲ-1C,或Ⅲ-2A； E為H、或式ⅣA,ⅣB： 2.如權(quán)利要求1所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，C為O、或式Ⅱ所示基團：丙二腈(Ⅱ-1)或三氰基化合物(Ⅱ-2A)或多元取代雜環(huán)(Ⅱ-3A,3B,4A,5A)； 3.如權(quán)利要求1所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，A為O。4.如權(quán)利要求1所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，B為O。5.如權(quán)利要求1所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ為式Ⅰ-1,Ⅰ-2或Ⅰ-3： 6.如權(quán)利要求5所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，Ⅰ為式Ⅰ-1A,Ⅰ-2A,Ⅰ-1B,Ⅰ-1C,Ⅰ-1D,Ⅰ-2D,Ⅰ-1E,Ⅰ-1F,或Ⅰ-1G； 7.如權(quán)利要求6所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針，其特征在于，Ⅰ為式1-1D-1或1-1D-2； 8.如權(quán)利要求1～7中任意一項所述的基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針作為內(nèi)標比率型探針的應(yīng)用。9.一種基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針的制備方法，是以熒光素衍生物作為起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈作為輔助熒光單元，以丙烯?；?,4-二硝基苯磺?；鳛樯飿酥疚镯憫?yīng)單元，制備得到可對熒光探針吸收波長及雙通道熒光發(fā)射波長調(diào)控的熒光探針。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種基于熒光素衍生物的內(nèi)標比率型熒光探針的制備方法，其特征在于，所述吸收波長為400nm-750nm；雙通道熒光發(fā)射，通道一發(fā)射波長為520nm，通道二發(fā)射波長為517nm-720nm。