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人類血小板抗原基因分型液相芯片及其檢測方法

  • 專利類型:發(fā)明專利
  • 有效期:不限
  • 發(fā)布日期:2021-11-02
  • 技術(shù)成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態(tài)核實
  • 簽署交易協(xié)議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(shù)(專利)類型 發(fā)明專利
  • 申請?zhí)?專利號 CN201110171128.0 
  • 技術(shù)(專利)名稱 人類血小板抗原基因分型液相芯片及其檢測方法 
  • 項目單位 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
  • 發(fā)明人 安群星,李翠瑩,白艷軍,穆士杰 
  • 行業(yè)類別 醫(yī)療器械-醫(yī)療實驗室
  • 技術(shù)成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯(lián)系人 許慶航
  • 發(fā)布時間 2021-11-02  
  • 01

    項目簡介

    本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種人類血小板抗原基因分型液相芯片及其檢測方法。人類血小板抗原基因分型技術(shù)是為患者提供相配合的血小板、促進臨床血小板輸注的安全性和有效性的重要技術(shù)手段,但現(xiàn)有的人類血小板抗原基因分型技術(shù)存在通量低、準確度和靈敏度等指標均有待提高等問題。本發(fā)明所述的液相芯片包含有引物1-24、連接探針25-46和包被有檢測探針47-68的熒光編碼微球,經(jīng)過擴增、連接和雜交反應(yīng)完成人類血小板抗原基因分型檢測。本發(fā)明所采用的液相芯片和檢測方法具有通量大、敏感性高、特異性強、重復性好、線性范圍寬、操作簡單、靈活性強、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點,是臨床上準確、高效而實用的人類血小板抗原基因分型檢測方法。
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  • 02

    說明書

    1.人類血小板抗原基因分型液相芯片,其特征在于:所述的液相芯片包含有:(1)擴增出包含有人類血小板抗原22種基因型SNP位點的目標序列的引物1-24:引物1-12的序列分別為SEQ?ID?NO.1-12,擴增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在內(nèi)的六個目標片段;引物13-24的序列分別為SEQ?ID?NO.13-24,擴增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在內(nèi)的六個目標片段;引物1-24的濃度配比為:(2)用于區(qū)分22種SNP位點的特異性連接探針25-46,序列分別為SEQ?ID?NO.25-46,每個探針是針對每一個SNP位點的前后相鄰的兩個寡核苷酸片段,即前端連接探針和后端連接探針;SEQ?ID?NO.25-46的前端連接探針和后端連接探針的基因型分別為:(3)分別包被有對應(yīng)人類血小板抗原22種SNP位點的特異性檢測探針SEQ?ID?NO.47-68的熒光編碼微球。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片,其特征在于:所述的前端連接探針的末位堿基為區(qū)別SNP突變的堿基,前端連接探針的首位堿基標記有生物素,后端連接探針的首位堿基有磷酸化修飾,在堿基完全匹配的情況下有耐熱連接酶將前端后端連接探針進行共價連接,形成首位堿基有標記有生物素的多堿基核苷酸鏈。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片,其特征在于:所述的對應(yīng)人類血小板抗原22種SNP位點的特異性檢測探針SEQ?ID?NO.47-68,分別選自HPA1、HPA2、HPA3、HPA4、HPA5、HPA15、HPA6、HPA7、HPA8、HPA9、HPA10?、HPA11、HPA12、HPA13、HPA14、HPA16抗原決定基因堿基突變位點兩側(cè)序列,包括特異序列、連續(xù)10個T堿基間隔序列及修飾合成的氨基。4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片的檢測方法,其特征在于:由以下步驟實現(xiàn):步驟一:采用兩組擴增引物SEQ?ID?NO.1-24在兩個擴增管中對檢測DNA樣本進行多重PCR擴增,并將兩管中的產(chǎn)物進行等量混合,獲得包含有22種SNP位點所在的目的片段;引物1-24的濃度配比為:步驟二:以上述獲得的擴增產(chǎn)物為模板,用連接探針SEQ?ID?NO.25-46在同一管中進行多重連接反應(yīng),獲得樣品中存在的代表各基因型的單鏈連接產(chǎn)物;步驟三:連接產(chǎn)物同包被有特異性探針SEQ?ID?NO.47-68的熒光微球進行雜交反應(yīng),隨后通過連接產(chǎn)物前端堿基上標記的生物素和鏈親和素-藻紅蛋白熒光標記分子反應(yīng),從而形成熒光微球-特異性探針-單鏈連接產(chǎn)物-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復合物;步驟四:通過流式熒光檢測儀進行信號閱讀。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片的檢測方法,其特征在于:所述的步驟一中的擴增溫度為95℃,變性3分鐘;然后95℃溫度下30s、52℃溫度下30s、72℃溫度下30s?5?個循環(huán),95℃溫度下30s、?55℃溫度下30s?、72℃溫度下30s?30個循環(huán);最后72℃溫度下延伸1分鐘;PCR擴增使用的酶為taq聚合酶。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片的檢測方法,其特征在于:所述的步驟二中的連接反應(yīng),其反應(yīng)體系包括1X?thermo?stable?ligase?reaction?buffer,兩管多重擴增產(chǎn)物各1μl,連接探針各0.2μM,thermo?stable?ligase?4U,總體積為20μl;連接溫度為95℃,變性3分鐘,然后95℃溫度下30s、?60℃溫度下30s?30個循環(huán);?連接反應(yīng)使用的連接酶為90N耐熱連接酶。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人類血小板抗原基因分型液相芯片的檢測方法,其特征在于:所述的步驟三中的雜交反應(yīng)為,將液相芯片放置于室溫下靜置30分鐘平衡溫度;微球于振蕩器上震蕩30秒,充分懸浮微球;取微球20μl置于雜交反應(yīng)室內(nèi);每個反應(yīng)加入連接產(chǎn)物1.5μl;貼上合適的封板紙,并于振蕩器上震蕩10秒鐘充分混勻;置于控溫器上,設(shè)置并運行如下溫度程序:94℃?溫度下3??min、50℃?溫度下30?min,此運行時按照80μl/反應(yīng)的體積準備熒光素,并孵育至溫度為50℃,同時請將Luminex加熱裝置設(shè)定為52℃,運行結(jié)束后每孔加入熒光素80μl,并繼續(xù)在50℃下孵育10分鐘。
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專利技術(shù)附圖

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