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一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-10-10
  • 技術成熟度:詳情咨詢
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201611136122.9 
  • 技術(專利)名稱 一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用 
  • 項目單位 合肥工業大學
  • 發明人 張洪斌,王超,李瑤,李夢琦,胡雪芹 
  • 行業類別 健康用品-營養保健品
  • 技術成熟度 詳情咨詢
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 吳詠淇
  • 發布時間 2021-10-10  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用,其中高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法是以右旋糖酐蔗糖酶基因為模板,去除3’端的1584bp堿基、保留上游3000bp堿基dex?YG?bMU01后重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得的BL21(DE3)/dex?YG?bMU01基因工程菌。本發明構建的BL21(DE3)/dex?YG?bMU01右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌,合成的右旋糖酐支鏈化程度提高,其中的α(1?3)比例從原來的5%提高到了17%,其水溶液黏度增加,絮凝效果方面得到明顯改良,其產酶仍然保持了較高的活性。
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  • 02

    說明書

    1.一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法,其特征在于:將核苷酸序列為SEQID NO:2的dex-YG-bMU01重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌;所述BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,分類命名為高枝化型重組右旋糖酐蔗糖酶大腸桿菌BL21(DE3),保藏日期2016年05月12日,保藏編號CGMCC No.12437。2.根據權利要求1所述的構建方法,包括引物設計、重組質粒構建和宿主菌轉化各單元過程,其特征在于:所述引物設計是根據右旋糖酐蔗糖酶基因序列和載體pET-28a-(+)的序列,借助Primer Primer 5軟件設計引物如下:上游引物選擇BamHI作為酶切位點:5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’下游引物選擇Hind III作為酶切位點:5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’;所述重組質粒構建是以右旋糖酐蔗糖酶基因為模板,利用PCR擴增技術,得到含BamH I和Hind III酶切位點截短后的基因克隆片段dex-YG-bMU01;將上述的基因克隆片段用BamHI和Hind III雙酶切,酶切產物連接到載體pET-28a-(+)的雙酶切位點上,得到重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01;所述宿主菌轉化是將重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中,經過卡那霉素抗性篩選、酶切、菌液PCR和DNA測序驗證后,獲得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。3.一種權利要求1所述的高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的表達應用,其特征在于:將基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5%的接種量接種到含有40~60μg/ml卡那霉素的LB培養基中,轉速250r/min,35~40℃培養16~18小時;從上述培養液中吸取2mL加入至200mL的A培養基中,放置于37℃下搖床培養,當富集培養的菌液用蒸餾水稀釋10倍后的OD600在0.20~0.24時即可加入500μL IPTG開始誘導產酶,保持25℃誘導發酵4-6小時,將誘導發酵后的菌懸液在0℃下,6000r/min離心12~15min,一支離心管對應一瓶菌懸液,然后加入蒸餾水振蕩清洗,再次離心;向每支離心管中加入20mL pH值5.4的醋酸-醋酸鈣緩沖液震蕩搖勻,外加冰水浴,超聲破碎15min,離心分離,上清液即為粗酶液,酶活80-100U/mL。4.根據權利要求3所述的表達應用,其特征在于:所述A培養基中各組分及濃度為:甘油5g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨10g/L,硝酸鉀10g/L,Na2HPO4·12H2O 17.105g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1g/L,MgSO4·7H2O 0.1mM/L。5.根據權利要求3所述的表達應用,其特征在于:搖床培養采用220~240r/min往復式搖床培養或者260~280r/min回轉式搖床培養。6.根據權利要求3所述的表達應用,其特征在于:誘導發酵采用220~230r/min往復式搖床誘導發酵或者250~260r/min回轉式搖床誘導發酵。
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