本發(fā)明涉及一種表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌及制備方法和應(yīng)用，步驟如下：(1)通過重疊PCR將cA基因與hMT基因拼接，兩基因之間引入linker，N端引入促表達(dá)標(biāo)簽，得到重組cA?hMT基因；(2)將重組cA?hMT基因和表達(dá)載體進(jìn)行連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；(3)將步驟(2)得到的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，收獲菌體超聲破碎后離心，上清液直接與食品級乳酸乳球菌孵育，融合蛋白無需純化則錨定至乳酸乳球菌表面。本發(fā)明方法制備的這種表面錨定有人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸菌，能夠富集重金屬，制備方法具有高效、安全無毒性、成本低、不需蛋白純化等優(yōu)點(diǎn)。

1.一種表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌的制備方法，其特征在于，包括
如下步驟：
(1)構(gòu)建含錨定單元的人I型金屬硫蛋白的重組融合表達(dá)載體：
通過重疊PCR將cA基因與hMT基因進(jìn)行拼接，兩基因之間引入linker，N端引入促表達(dá)標(biāo)
簽，得到重組cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hMT基因的核苷酸序列
如SEQ ID NO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)將重組cA-hMT基因連接至表達(dá)載體pET21a，再將得到的連接產(chǎn)物pET21a-cA-hMT轉(zhuǎn)
化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)過鑒定得到工程菌；
(3)將步驟(2)得到的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白cA-hMT，收獲菌體后超聲破碎，將上清
液直接與乳酸乳球菌室溫孵育，融合蛋白cA-hMT則錨定到乳酸乳球菌表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)的重組表達(dá)還需加入分子伴侶，具
體步驟如下：
將步驟(2)所述的連接產(chǎn)物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侶的表達(dá)載體先后轉(zhuǎn)化至大
腸桿菌的表達(dá)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述分子伴侶為dnaK，dnaJ，grpE，groES和
groEL中的一種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌還經(jīng)如下預(yù)處理：
將乳酸乳球菌濕菌體加醋酸處理并煮沸30min，PBS洗滌后再與重組融合蛋白cA-hMT進(jìn)行錨
定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)重組融合
蛋白cA-hMT的步驟如下：
a.將工程菌接種于含氨芐青霉素和氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，于37℃、180rpm振搖過夜，
然后按1：100的比例接種于含有氨芐青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD
達(dá)0.4～0.8時加入終濃度為0.5～1.0mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm、低溫繼
續(xù)培養(yǎng)12h后收集菌液，離心得到菌體；
b.用PBS緩沖液洗滌步驟a所得菌體2次，用細(xì)菌裂解液重懸，置于冰浴下超聲破碎，取
超聲后的勻漿物離心，分別收集上清液和包涵體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)將融合蛋白cA-hMT錨定到乳酸乳
球菌表面的步驟如下：
將上清液直接與乳酸乳球菌重懸，室溫靜置1h，9000g離心2min棄上清，沉淀用PBS溶液
洗滌3次，重懸至4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述乳酸乳球菌為MG1363、
MG1614、LM0230。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌的培養(yǎng)步驟如下：
將乳酸乳球菌在GM17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃厭氧靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長期晚期或平臺
期，OD_600nm達(dá)3～4，室溫9000g離心5min，收集濕菌體。
9.權(quán)利要求1～8任一項方法制得的表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌。
10.權(quán)利要求9所述表面錨定人I型金屬硫蛋白的食品級乳酸乳球菌的應(yīng)用，其特征在
于，所述乳酸乳球菌用于人體重金屬解毒、修復(fù)重金屬氧化損傷、金屬離子代謝調(diào)節(jié)以及廢
水廢氣處理和環(huán)境修復(fù)。