本發(fā)明公開了一種檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有萊克多巴胺抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述萊克多巴胺抗體特異結(jié)合的抗抗體。本發(fā)明的實驗證明，用本發(fā)明提供的試紙檢測萊克多巴胺，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。

1.一種檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克
多巴胺抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應(yīng)墊、連接于所述反應(yīng)墊另一端的
吸水墊；所述反應(yīng)墊包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有萊克多巴胺
抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述萊克多巴胺抗體特異結(jié)合的抗抗體；
所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜；
所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體為萊克多巴胺抗體和超順磁性復(fù)合
粒子的肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體；
所述萊克多巴胺抗體為萊克多巴胺單克隆抗體；
所述與所述萊克多巴胺抗體特異結(jié)合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；
所述萊克多巴胺抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為1mg/ml；
所述萊克多巴胺抗原為萊克多巴胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述萊克多巴胺
半抗原為萊克多巴胺；所述載體蛋白為BSA；所述載體蛋白與萊克多巴胺半抗原的偶
聯(lián)比為1:10；
所述超順磁性復(fù)合粒子為Fe₃O₄納米粒子；
所述超順磁性復(fù)合粒子的粒徑為100nm；
所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度為40emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20
秒；所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量為80μmol/g；
所述萊克多巴胺抗體親和常數(shù)為10⁸M^-1；
所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體按照如下方法制備：
1）將每2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0.96mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞
胺、1.15mg?N-羥基丁二酰亞胺和1ml濃度為0.1M、pH值為4.7的2-(N-嗎啡啉）乙
磺酸緩沖液混勻，反應(yīng)，得到活化后磁性粒子；所述反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為
0.5h；
2）將每2.5mg步驟1）得到活化后磁性粒子、0.15mg萊克多巴胺抗體和0.8ml
濃度為50mM?pH為8.5的硼砂緩沖液混勻、反應(yīng)，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；
所述反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時間為3.5h；
3）向步驟2）得到的反應(yīng)液中加入BSA混勻得到混合液、反應(yīng)，得到含有封閉
后磁性粒子的反應(yīng)液；反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為0.5h；
所述BSA在所述混合液中的質(zhì)量百分濃度為5%；
所述萊克多巴胺抗原按照如下方法制備：
A）取每0.68g萊克多巴胺、42.5ml吡啶、0.24g丁二酸酐混勻，回流、去吡啶，
得到萊克多巴胺丁二酸酐酰化物；所述回流溫度為50℃，所述回流時間為24h；所述
去除吡啶采用在50℃進行減壓蒸餾24h；
B）取每40ml?N,N-二甲基甲酰胺與40ml二氧六環(huán)混合，得到混合液a，用混合液
a溶解步驟A）得到的萊克多巴胺丁二酸酐酰化物得到萊克多巴胺丁二酸酐酰化物溶
液；
C）將每8ml步驟B）得到的萊克多巴胺丁二酸酐酰化物溶液和52.4μl三丁基正
胺混合，再加入30μl氯甲酸異丁酯反應(yīng)，得到活化后萊克多巴胺；所述混合的溫度為
4℃，所述混合的時間為15min，所述反應(yīng)的溫度為25℃，所述反應(yīng)的時間為1h；
D）取每100mg載體蛋白溶解于10ml0.1mol/L，pH為8.5的硼酸鈉溶液，得到載
體蛋白硼酸鈉溶液；
E）將每10ml步驟D）得到的載體蛋白硼酸鈉溶液加入8.082ml步驟C）得到的
活化后萊克多巴胺反應(yīng)，得到反應(yīng)液b,反應(yīng)液b經(jīng)透析、純化、凍干，得到萊克多巴
胺抗原；所述反應(yīng)溫度為4℃，所述反應(yīng)時間為12h；
所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體的制備方法中：
在所述步驟3）后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液中的封閉后磁性
粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體的步驟，所述洗滌
液和懸浮液均為濃度為0.02M?pH為7.4的PBS緩沖液。
2.一種制備檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙的方法，包括如下步驟：
Ⅰ、分別制備樣品墊和含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；
Ⅱ、將步驟Ⅰ得到的樣品墊、步驟Ⅰ得到的含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊與吸水
墊依次粘貼到背板上，得到檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙；
所述含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊按照如下方法制備：將權(quán)利要求1中試紙中的
所述萊克多巴胺抗原和權(quán)利要求1中試紙中的所述與萊克多巴胺抗體特異結(jié)合的抗抗
體分別噴在反應(yīng)墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線
的反應(yīng)墊；
所述樣品墊按照如下方法制備：將權(quán)利要求1中試紙中的所述超順磁性復(fù)合粒子
標(biāo)記萊克多巴胺抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：
在所述樣品墊制備方法中：在將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體噴到
所述玻璃纖維紙上前，還包括預(yù)處理所述玻璃纖維紙和預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子
標(biāo)記萊克多巴胺抗體的步驟：
所述預(yù)處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙在緩沖液中浸泡1小時，
所述緩沖液按照如下方法制備：將每2mlTritonX100、10g?BSA、50g蔗糖和950ml
濃度為0.02M、pH為7.4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7.4，并定容到1000ml；
所述浸泡的時間為1小時，浸泡的溫度為37℃；
所述預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記萊克多巴胺抗體為將所述超順磁性復(fù)合粒
子標(biāo)記萊克多巴胺抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍；
所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：
在步驟Ⅰ后，步驟Ⅱ前，還包括干燥步驟Ⅰ得到的樣品墊與步驟Ⅰ得到的含有檢
測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。
5.權(quán)利要求1所述試紙在檢測樣品中殘留萊克多巴胺中的應(yīng)用，所述樣品具體為
動物組織樣本、動物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述樣品為豬尿。