一種乙醛?DNA加合物的測定方法，即DNA中Ethylidene?dG和Propano?dG的測定方法，包括采用乙醛溶液暴露小牛胸腺DNA并加入精氨酸作為反應的催化劑，DNA溶液進行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內標、還原劑NaBHCN和DNA水解酶。水解液經Strata?X小柱固相萃取，收集洗脫液并引入LC?MS/MS系統分析，可準確檢測出Et?dG和Propano?dG的含量水平。本發(fā)明為全新的DNA中乙醛?DNA加合物的測定方法，采用穩(wěn)定同位素作為內標定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差，串聯質譜法更好的提高了方法的選擇性、準確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機溶劑的消耗量。

1.一種乙醛-DNA加合物的測定方法，所述乙醛-DNA加合物是N²-亞乙基-鳥嘌呤
（Ethylidene-dG）、1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具體步驟：
a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，對照組加入
同等體積的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h；使
用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣
品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在
260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當于50 μg/mL；
b、DNA的酶水解及固相萃?。⊿PE）：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM
MgCl₂緩沖液中，加入30 mg 的還原劑NaBH₃CN，將N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）還原
成N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）來檢測，加入20 μL混合內標，加入60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃
中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續(xù)孵育2h，水解液經1
mL甲醇活化和1 mL超純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇
水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液；
c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）、1,N²-丙醇-鳥
嘌呤（Propano-dG）標準工作溶液；
d、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注
入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的
比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量；在LC-MS/MS測定中，選取
Thermo Acclaim^TM Polar Advantage II C18 色譜柱，規(guī)格4.6×150 mm，3 μm，流動相體系
選取甲醇A和純水溶液B，等度洗脫條件為：0-15 min：35% A；流速為0.40 mL/min，分析時間
為15 min，進樣量為5 μL；
串聯質譜檢測器條件如下：電噴霧離子源（ESI），多反應監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電
壓：5500 V，離子源溫度：550℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi， 干燥氣為75 psi，
碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：200 ms；監(jiān)測離子對為Et-dG：
296.2→180.2定量離子對，296.2→117.2定性離子對；內標[¹⁵N₅]Et-dG為271.2→155.2；
Propano-dG：338.3→222.1定量離子對，338.3→117.2定性離子對；內標[¹⁵N₅]Propano-dG
為343.2→227.2。
2.根據權利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中的乙醛溶
液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.00-1 mM。
3.根據權利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述混合
內標為100 ng/mL的[¹⁵N₅]Et-dG和[¹⁵N₅]Propano-dG。