本發(fā)明公開了一種可對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行定性和定量分析的方法，其包括如下步驟：a)利用抗凝血酶III的親和色譜柱對依諾肝素鈉樣品進(jìn)行分離并制備成多個不同親和活性的組分；b)用混合肝素酶對依諾肝素鈉樣品及多個不同親和活性的組分分別進(jìn)行完全酶解；c)對每一個完全酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離分析；d)根據(jù)公式：計算所分離的各個成分的電泳淌度；e)結(jié)合寡糖的電荷質(zhì)量比與電泳淌度之間的如下線性關(guān)系：對每一個完全酶解產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖中的分離峰所對應(yīng)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以定性確定出五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰；f)根據(jù)所確定的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰的峰面積，定量計算出五糖結(jié)構(gòu)單元的含量。

1.一種可對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行定性和定量分析的方法，其特征在于，包括如下步驟：a)利用抗凝血酶III的親和色譜柱對依諾肝素鈉樣品按親和活性進(jìn)行分離并制備成多個不同親和活性的組分；所述的抗凝血酶III的親和色譜柱的制備包括如下步驟：①使過量的依諾肝素鈉樣品與抗凝血酶III進(jìn)行孵育，以激活抗凝血酶III并占據(jù)其活性位點(diǎn)；②使活性位點(diǎn)被保護(hù)的抗凝血酶III以共價鍵固定到色譜柱內(nèi)的水化填料上；其中，依諾肝素鈉與抗凝血酶III的質(zhì)量比為2.5:1～5:1；進(jìn)行孵育的緩沖溶液的pH為8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氫鈉溶液與450～550mmol/L的氯化鈉溶液形成；1毫升水化填料中含抗凝血酶III的質(zhì)量≤5毫克；b)用混合肝素酶對依諾肝素鈉樣品及步驟a)所制備的多個不同親和活性的組分分別進(jìn)行完全酶解；c)對步驟b)所得到的每一個完全酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離分析；d)根據(jù)公式：計算步驟c)所分離的各個成分的電泳淌度，其中：L_T和L_D分別是毛細(xì)管的總長和有效長度，V為分離電壓，t為遷移時間；e)結(jié)合寡糖的電荷質(zhì)量比與電泳淌度之間的如下線性關(guān)系：對每一個完全酶解產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖中的分離峰所對應(yīng)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以定性確定出五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰；其中：Z/M為寡糖電荷質(zhì)量比，μ為對應(yīng)的電泳淌度；f)根據(jù)所確定的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰的峰面積，采用面積百分?jǐn)?shù)歸一化方法，定量計算出五糖結(jié)構(gòu)單元的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的水化填料是由NHS或CNBr官能團(tuán)化的瓊脂糖。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)利用抗凝血酶III的親和色譜柱制備不同親和活性組分的步驟包括：Ⅰ)洗脫抗凝血酶III所結(jié)合的依諾肝素鈉；Ⅱ)平衡色譜柱；Ⅲ)上樣；Ⅳ)進(jìn)行梯度洗脫和色譜分離。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗凝血酶III為野生型或重組型。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅱ)采用含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行平衡10～20分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅲ)先采用含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液溶解樣品，配制成濃度為10～140mg/mL的樣品溶液，然后以進(jìn)樣量為1～30μL進(jìn)行上樣。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟Ⅳ)進(jìn)行梯度洗脫的條件為：0～15分鐘：A相為100％，B相為0；15～20分鐘：A相為65％～75％，B相為25％～35％；20～35分鐘：A相為0％，B相為100％；所述的A相為含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液，所述的B相為含有1.5～4.0mol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟Ⅳ)進(jìn)行色譜分離的條件為：流動相為pH7.0～8.0、濃度為5～20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液；分離時，流動相和色譜柱均保持1～15℃；檢測波長為紫外230～235nm。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b)中所述的混合肝素酶包括肝素酶I，肝素酶II和肝素酶III中的至少兩種。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于：所述混合肝素酶是包含肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合溶液。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離的分析條件為：石英毛細(xì)管總長為50～100cm，柱內(nèi)徑為25～75μm；緩沖溶液含有150～300mmol/LTris-H₃PO₄和1～5mmol/L的MgCl₂，pH為1.5～4.0，使用前需加入0.1～5.0％質(zhì)量濃度、分子量范圍為5000～100000的聚乙二醇；毛細(xì)管電泳時使用電壓為-15～-30kV；采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為1～5psi，進(jìn)樣時間為5～30s；在最后一個單硫酸化二糖出峰之后施加1～10psi的壓力；電泳時毛細(xì)管柱溫為10～40℃，檢測波長為紫外230-235nm。