本發明的目的是提供一種簡便、快速、靈敏度高和全自動化的苯巴比妥藥物濃度檢測設備及其制備方法，為了解決上述技術問題，本發明提供一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒及其制備方法，包括苯巴比妥免疫原的合成，抗苯巴比妥特異性抗體的制備，酶標偶聯物的制備以及樣本的測定。本發明的苯巴比妥藥物濃度均相酶免疫檢測試劑盒準確度和精確度高，血清標本的平均回收率大于95％，相關系數偏差小于2.5％。該試劑盒中提供的苯巴比妥抗體的特異性強，藥物交叉反應試驗中，對測試的30種常見藥物和化合物幾乎無任何交叉反應，適合臨床檢測苯巴比妥的血藥濃度。本發明的試劑盒簡便、快速、成本低、靈敏度高、可全自動化。

1.一種苯巴比妥均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方
法包括以下步驟：苯巴比妥衍生物特異的單克隆或多克隆抗體的制備；葡萄糖
六磷酸脫氫酶標記的特異苯巴比妥衍生物的制備；定標液的制備；
所述苯巴比妥衍生物特異多克隆抗體的制備包括以下步驟：
步驟a：
將牛血清白蛋白溶解于0.2mol/L的pH8.5的磷酸緩沖液中；
苯巴比妥衍生物的活化：將特異的苯巴比妥衍生物10mg置于容器中，并依
次加入350μL二甲基酰胺、350μL乙醇、700μL磷酸鉀緩沖液、40mg1-乙基
-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和5mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述磷酸鉀緩沖液
濃度為10mmol/L，pH值為5.0；
步驟b：苯巴比妥衍生物免疫抗原的偶聯和純化：將步驟a活化的苯巴比妥
衍生物滴加到步驟a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2～8℃條件下攪拌12-16
小時，將偶聯的抗原進行孔徑為8KD的透析袋透析純化；
步驟c：將步驟b合成的苯巴比妥免疫抗原用10mmol/L，pH7.4的磷酸緩沖
液稀釋至1.0mg/mL，然后用苯巴比妥免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對兔
子進行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一
次，之后每隔28天注射一次，從兔子進行初次注射開始，經過4個月后獲得的
抗體；
所述葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的苯巴比妥衍生物的制備包括以下步驟：
a、將15mg葡萄糖六磷酸脫氫酶溶解于12mLTris緩沖液中，然后依次加入
225mg還原型輔酶Ⅰ、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亞
砜；所述Tris緩沖液pH為9.0，各組分濃度為：0.05mol/LTris、3.3mmoL/L
氯化鎂,145.4mmol/L氯化鈉；
b、苯巴比妥衍生物的活化：將10mg苯巴比妥衍生物溶解于420μL二甲基
亞砜和180μL二甲基甲酰胺中，加入6μL三丁胺和350μL氯甲酸異丁酯在2～
8℃條件下攪拌30分鐘；
c、將所述步驟a和b所得溶液混合，在2～8℃條件下攪拌12-16小時，并
將偶聯的酶標抗原進行G-25凝膠層析柱純化，得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的
苯巴比妥衍生物。