本發明涉及同步檢測伏馬毒素B1等四種真菌毒素混合污染的免疫層析時間分辨熒光試劑盒及其應用。其包括免疫層析時間分辨熒光試紙條和含有銪標記的各單克隆抗體凍干品的樣品反應瓶；其中：所述熒光試紙條包括PVC襯底，襯底的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設置橫向質控線和四條檢測線，分別包被各毒素的牛血清白蛋白偶聯物，所述伏馬毒素B1單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO.C201636的雜交瘤細胞株Fm7A11分泌產生。可用于黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1含量的同步檢測，具有操作簡單、快速、靈敏度高的特點。

1.同步檢測黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1混合污染的免疫
層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：它包括免疫層析時間分辨熒光試紙條和含有銪標
記的黃曲霉毒素B1單克隆抗體、銪標記的赭曲霉毒素A單克隆抗體、銪標記的玉米赤霉烯酮
單克隆抗體、銪標記的伏馬毒素B1單克隆抗體凍干品的樣品反應瓶；其中：所述的免疫層析
時間分辨熒光試紙條包括PVC襯底，襯底的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊和樣品
墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上
而下設置橫向質控線和四條檢測線，所述質控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，所述四條檢測
線上分別包被黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物、玉
米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶聯物、伏馬毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物，所述的伏馬毒素B1
單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO. 201636的雜交瘤細胞株Fm7A11分泌產生的單克隆
抗體；所述的雜交瘤細胞株Fm7A11已于2016年3月29日保藏于中國典型培養物保藏中心，保
藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO. 201636。
2.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述銪標記的單
克隆抗體是按照以下方法制備得到：
銪標記的黃曲霉毒素B1單克隆抗體：將黃曲霉毒素B1單克隆抗體和活化后的銪標記試
劑在硼酸緩沖液中混合、振蕩反應，然后經離心、復溶、封閉步驟得到目標產物銪標記的黃
曲霉毒素B1單克隆抗體；1mL活化后的銪標記試劑可偶聯黃曲霉毒素B1單克隆抗體：30μg-
80μg；
銪標記的赭曲霉毒素A單克隆抗體：將赭曲霉毒素A單克隆抗體和活化后的銪標記試劑
在硼酸緩沖液中混合、振蕩反應，然后經離心、復溶、封閉步驟得到目標產物銪標記的赭曲
霉毒素A單克隆抗體；1mL活化后的銪標記試劑可偶聯赭曲霉毒素A單克隆抗體：40μg-90μg；
銪標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體：將玉米赤霉烯酮單克隆抗體和活化后的銪標記試
劑在硼酸緩沖液中混合，振蕩反應，然后經離心、復溶、封閉步驟得到目標產物銪標記的玉
米赤霉烯酮單克隆抗體；1mL活化后的銪標記試劑可偶聯玉米赤霉烯酮單克隆抗體：30μg-
90μg；
銪標記的伏馬毒素B1單克隆抗體：將伏馬毒素B1單克隆抗體和活化后的銪標記試劑在
硼酸緩沖液中混合，振蕩反應，然后經離心、復溶、封閉步驟得到目標產物銪標記的伏馬毒
素B1單克隆抗體；1mL活化后的銪標記試劑可偶聯伏馬毒素B1單克隆抗體：30μg-80μg。
3.根據權利要求2所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：銪標記試劑的活
化方法為取銪標記試劑用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸緩沖液中超聲分散，然后緩慢加入碳二
亞胺溶液，室溫振蕩活化，離心去上清液，用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸緩沖液復溶，備用，活
化時間為15-30min。
4.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述熒光試紙條
中的吸水墊長10-16mm，寬3-5mm；檢測墊長25-30mm，寬3-5mm；樣品墊長12-18mm，寬3-5mm，
相鄰各墊的交疊長度為1-3mm；所述熒光試紙條中檢測墊上靠近質控線的檢測線與硝酸纖
維素膜上沿的間距為5-10mm，每相鄰兩條檢測線之間的間距為1.5-4.5mm，靠近質控線的檢
測線與質控線的間距為3-5mm；所述的樣品反應瓶為1-2.5mL的西林瓶。
5.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述包被黃曲霉
毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物的檢測線上每厘米所需要的黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶
聯物的包被量為50-250ng；包被赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物的檢測線上每厘米所需
要的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物的包被量為100-300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清
白蛋白偶聯物的檢測線上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶聯物的包被量為
100-300ng；包被伏馬毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物的檢測線上所需要的伏馬毒素B1-牛血
清白蛋白偶聯物的包被量為50-150ng，每厘米質控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為
50-150ng。
6.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述樣品反應瓶
中銪標記的黃曲霉毒素B1單克隆抗體凍干品的含量為0.1-0.3μg，銪標記的赭曲霉毒素A單
克隆抗體凍干品的含量為0.1-0.3μg，銪標記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體凍干品的含量為
0.1-0.3μg，銪標記的伏馬毒素B1單克隆抗體凍干品的含量為0.1-0.3μg。
7.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述的黃曲霉毒
素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1免疫層析時間分辨熒光速測試劑盒還包括
樣品稀釋液和樣品稀釋液吸管，所述的樣品稀釋液為體積分數為0.01％-0.30％的吐溫-20
水溶液。
8.根據權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光試劑盒，其特征在于：所述的時間分辨
熒光試紙條的制備方法如下：
(1)將吸水紙剪裁得吸水墊；
(2)檢測墊的制備：
將黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物、玉米赤霉
烯酮-牛血清白蛋白偶聯物、伏馬毒素B1-牛血清白蛋白偶聯物配制成濃度為0.10-0.50mg/
mL的包被液，用線噴方式將其于硝酸纖維素膜上進行分別間隔包被，得到4條檢測線，然后
于37-40℃條件下干燥60-120分鐘；
將兔抗鼠多克隆抗體配成濃度為0.1-0.5mg/mL的包被液，用線噴方式將其橫向包被于
硝酸纖維素膜上，得質控線，然后于37-40℃條件下干燥60-120分鐘；
(3)樣品墊的制備：
將玻璃纖維膜放入封閉液中浸濕，取出，于37-40℃條件下干燥4-6小時，得樣品墊，然
后置干燥器中室溫保存；
(4)免疫層析時間分辨熒光試紙條的組裝：
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊、樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連
接，即得熒光試紙條。
9.權利要求1所述的免疫層析時間分辨熒光速測試劑盒在黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素
A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1含量檢測中的應用，其特征在于：將待測樣品經前處理獲得待
測樣品溶液后，加入樣品反應瓶中，混勻，插入時間分辨熒光試紙條，37℃反應10分鐘后，用
時間分辨熒光測試儀進行檢測，獲得熒光試紙條上檢測線熒光強度與質控線熒光強度的比
值；基于預先獲得的熒光試紙條檢測線時間分辨熒光強度與質控線熒光強度的比值分別與
黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1濃度的關系曲線，獲得待測樣品溶
液中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1的含量，最后經換算即得待測
樣品中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1的含量。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述的免疫層析時間分辨熒光試紙條檢
測線熒光強度與質控線熒光強度的比值分別與黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯
酮、伏馬毒素B1濃度的關系曲線是采用以下方法得到的：
(1)配制得到系列梯度濃度的黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯
酮標準溶液；
(2)將適量上述各梯度的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1標準
品溶液分別加入到樣品反應瓶中，混勻，插入熒光試紙條，37℃反應6-10分鐘，用時間分辨
熒光免疫分析儀檢測得到各熒光試紙條上檢測線和質控線的熒光強度值，由此獲得各熒光
試紙條檢測線時間分辨熒光強度與質控線熒光強度的比值；
(3)經擬合得到免疫層析時間分辨熒光試紙條檢測線熒光強度與質控線熒光強度的比
值與黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的關系曲線。