區(qū)分新城疫病毒樣顆粒疫苗免疫血清與野毒感染血清的間接競爭ELISA方法及試劑盒，屬于病毒檢測領(lǐng)域。本發(fā)明以NP蛋白為免疫抗原，以單克隆抗體為抗體診斷試劑，利用棋盤法對包被抗原及單抗?jié)舛冗M行優(yōu)化，對包被時間、一抗?jié)舛燃胺跤龝r間、二抗?jié)舛燃胺跤龝r間等條件優(yōu)化；根據(jù)工作濃度將免疫抗原包被于ELISA孔中，同時以不同稀釋倍數(shù)的樣本血清與固定稀釋倍數(shù)的單克隆抗體混合后進行阻斷實驗，將混合物與固相抗原結(jié)合作用，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗繼續(xù)孵育，用TMB顯色液顯色，加入2M硫酸溶液終止反應(yīng)。本發(fā)明可有效移除傳染源，消滅持久疫源地的存在，為新城疫的凈化提供理論依據(jù)，具有檢測靈敏、準(zhǔn)確，操作簡便及特異性強的優(yōu)點。

1.區(qū)分新城疫病毒樣顆粒疫苗免疫血清與野毒感染血清的試劑盒，其特征在于，包括：NP蛋白、單克隆抗體、酶標(biāo)二抗、可溶型單組分TMB底物溶液、硫酸；所述NP蛋白的濃度為0.781μg/mL，所述單克隆抗體的稀釋倍數(shù)為1:800，所述單克隆抗體的孵育時間為90min，所述酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1:5000，所述酶標(biāo)二抗的孵育時間為60min；所述單克隆抗體的制備方法如下：步驟一、制備免疫抗原(1)將NP蛋白基因克隆至T載體中，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒T+NP，并測序鑒定；所述NP蛋白基因來源于新城疫病毒流行優(yōu)勢強病毒株NA-1株；(2)對重組克隆質(zhì)粒T+NP和pET28a(+)載體進行雙酶切，將回收的目的基因及載體基因進行連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a+NP；(3)對重組表達質(zhì)粒pET28a+NP進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)純化后獲得NP蛋白，作為免疫抗原；步驟二、制備單克隆抗體(1)將純化的NP蛋白免疫BALB/c小鼠，再將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞進行融合篩選，制備雜交瘤細胞株；(2)將雜交瘤細胞株腹腔注射BALB/c小鼠，取腹水加以純化，即為單克隆抗體，作為抗體診斷試劑；所述NP蛋白采用步驟一的方法制備；所述新城疫病毒樣顆粒由M蛋白、F蛋白和HN蛋白構(gòu)成，不含有NP蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述NP蛋白基因的構(gòu)建過程如下：以新城疫病毒流行優(yōu)勢強病毒株NA-1為模板，采用PCR擴增NP基因，引物序列如下：NP-Nhe I-F：5’-CGGCTAGCATGTCGTCTGTCTTTGACGAA-3’，NP-Not I-R：5’-ATTTGCGGCCGCGATCAGTATCCCCAATCAGTGTC-3’；PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30秒、65℃退火30s、72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％(m/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，進行膠回收純化。