1.耐酸中溫α-淀粉酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟A1，前體α-淀粉酶基因的擴增：提取枯草芽孢桿菌染色體DNA，選用保藏
編號為CICC?10028的枯草芽孢桿菌；根據Genbank中已報道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基
因為依據，設計如下引物：
上游引物F1：5’-GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’
(SEQ?ID?NO：1)；
下游引物R1：5’-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’
(SEQ?ID?NO：2)；
PCR產物經純化、雙酶切后，連接到同樣經雙酶切線性化的pET-22b，轉化大腸桿
菌JM109，得到pET22-ACN7；
步驟A2，前體α-淀粉酶的的定點突變：設計含突變氨基酸殘基的互補引物如下：
引物1：5’-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3’(SEQ?ID?NO：4)
引物2：5’-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3’(SEQ?ID?NO：5)
引物3：5’-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3’(SEQ?ID?NO：6)
引物4：5’-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3’(SEQ?ID?NO：7)
以重組質粒pET22-ACN7為模板進行PCR擴增，按以下次序，將各成分在薄壁離
心管內混合：PCR1：采用50μL體系，ddH2O38.5μL，10×buffer?5μL，2.5mmol/L的dNTP
用量2μL，20μmol/L的引物1用量2μL，20μmol/L的引物2用量2μL，DNA模板1μL，
pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；擴增條件為：94℃?2min，1個循環；94℃?40s，60℃，
40s，72℃，2min，20個循環；最后1個循環為72℃?7min；PCR2：采用50μL體系，
ddH2O38.5Ml，10×buffer?5μL，2.5mmol/L的dNTP用量2μL，20μmol/L的引物3用量
2μL，20μmol/L的引物4用量2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL.擴
增條件為：94℃?2min，1個循環；94℃?40s，60℃，40s，72℃，2min，20個循環；最后
1個循環為72℃?7min；
PCR產物經純化、轉化大腸桿菌XL-10感受態細胞，挑選陽性克隆，經過測序驗證，
最終得到含有突變α-淀粉酶基因的重組表達載體pET-ACN7-2；
步驟A3，突變α-淀粉酶表達載體的構建：枯草芽孢桿菌表達載體采用pWB980，
設計如下引物：
上游引物F2：5’-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’
(SEQ?ID?NO：9)；
下游引物R2：5’-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’
(SEQ?ID?NO：10)；
以重組表達載體pETCN7-2為模板進行PCR擴增，按以下次序，將各成分在滅菌
薄壁離心管內混合：采用50μL擴增體系：ddH2O?41.5μL，10×buffer?5μL，2.5mmol/L的
dNTP?1μL，20μmol/L的上游引物F2、20μmol/L的下游引物R2各0.5μL，DNA模板1μL，
TaqDNA聚合酶0.5μL.擴增條件為：94℃?2min，1個循環；94℃?40s，58℃，40s，72℃，
2min，30個循環；最后1個循環為72℃?10min；
將所得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化、雙酶切，然后連接到同樣雙
酶切線性化的pWB980載體上：在1.5mL離心管中加入12μL純化的DNA，4μL線性
pWB980載體，2μL?10×連接酶buffer，1μL?T4?DNA連接酶，加水至總體積為20μL，16℃
連接過夜；
步驟A4，表達載體轉化枯草芽孢桿菌，將步驟A3的連接混合物轉化枯草芽孢桿菌
WB600的感受態細胞，枯草芽孢桿菌轉化子提取質粒，提取的質粒用限制性內切酶
BamH?I和Sph?I進行酶切鑒定，測序，構建了枯草芽孢桿菌重組表達載體
pWB980-ACN7-2。
2.根據權利要求1所述的制備方法得到的耐酸中溫α-淀粉酶，其特征在于，
編碼耐酸中溫α-淀粉酶的突變體的DNA序列為SEQ?ID?NO：8。
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