本發明公開了一種靈敏特異的朊病毒蛋白(PrP)檢測方法與檢測試劑，其技術要點在于：將蛋白酶處理后的樣本流經偶聯能與朊病毒蛋白（PrP）特異識別并結合的重組G5P蛋白的Ni-NTA樹脂，洗滌后經洗脫緩沖液洗脫并收集，洗脫液所含的朊病毒蛋白（PrP）通過其特異抗體進行免疫印跡檢測或電泳后染色可被檢測。該方法結合了PrPSC蛋白酶抗性和與G5P高親和特性，有效消除正常PrP所致的假陽性，特異性強；蛋白純化效果好，抗體免疫檢測靈敏度高；該方法具有廣泛的應用前景和價值。該方法的建立對朊病毒的研究、疾病的診斷和控制有著重要的意義。

1.一種檢測朊病毒蛋白PrP^SC的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一：將待測樣本經10μM蛋白酶K消化，使樣本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影響；步驟二：將步驟一處理后的待測樣本流經飽和偶聯能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂，利用該重組G5P蛋白捕獲待測樣本中的朊病毒蛋白PrP^SC，所述的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白是由序列表中序列1基因編碼表達的；步驟三：用洗脫緩沖液對經過步驟二后的飽和偶聯能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂進行洗脫，收集洗脫液，所述的洗脫緩沖液的組成及濃度為：20mmol/L?Tris-Cl，150mmol/L?NaCl，500mmol/L咪唑，pH為7.0；步驟四：用以下方法檢測步驟三收集到的洗脫液中的朊病毒蛋白PrP^SC：(a)洗脫的PrP^SC為不溶性蛋白，量多則可見白色沉淀；或(b)洗脫后凝膠電泳經考馬斯亮藍染色出現明顯條帶即為PrP^SC；或(c)利用PrP^SC單克隆抗體進行PrP^SC的Western?blot檢測。2.一種用于檢測朊病毒蛋白PrP^SC的試劑盒，其特征在于，包括：(a)朊病毒蛋白PrP^SC的富集洗脫體系：即飽和偶聯能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂和洗脫緩沖液，所述的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白是由序列表中序列1基因編碼表達的；所述的洗脫緩沖液體系的組成及濃度為：20mmol/L?Tris-Cl，150mmol/L?NaCl，500mmol/L咪唑，pH為7.0；(b)蛋白酶K，用于樣本處理；(c)PrP^SC單克隆抗體，用于洗脫的朊病毒蛋白PrP^SC免疫印跡檢測；(d)說明書。3.一種重組表達載體，其特征在于，它是由序列表中序列1所示的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的G5P蛋白的編碼基因與攜帶His-Tag的pET-28a(+)質粒重組而成。4.一種能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識別并結合的重組G5P蛋白的克隆表達方法，包括以下步驟：步驟1、G5P重組子的構建：(1)參照GeneBank的Accession?No.J02450所示G5P氨基酸序列對應的基因序列，根據大腸桿菌BL21-DE3密碼子偏愛性設計出序列表中序列1所示的重組G5P蛋白表達基因；(2)通過DNASTAR比對，用引物設計軟件設計合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在兩端引入同pET-28a(+)質粒一樣含有的EcoR?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切位點，以便酶切連接；8段引物序列如下：Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT?Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT?Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT?Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA?Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA?Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG?Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA?Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG?其中Pr1的劃線部分是EcoR?I酶切位點，Pr8的劃線部分是Xho?I酶切位點；(3)利用重疊延伸PCR合成目的基因序列，并PCR擴增目的基因；重疊延伸PCR反應體系：PCR擴增目的基因的條件：(4)分別用Xho?I和EcoR?I于37℃水浴雙酶切目的基因和質粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，將兩者用T4DNA連接酶于16℃連接反應10h，得到重組子pET-28a(+)-c(+)-G5P，瓊脂糖凝膠電泳鑒定；步驟2、G5P重組子的表達：(1)將重組子pET-28a(+)-c(+)-G5P轉化于E.coli?BL21-DE3感受態細胞，涂布于含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃培養過夜；(2)取少量上述菌液按1：100比例轉接到新鮮LB液體培養基中，于37℃、200r/min搖床培養至OD600＝0.6～0.8；(3)加入一定量的0.2-1.2mM?IPTG誘導2-12h；(4)將誘導后的菌液冰浴30min，8000rpm離心20min，4℃，棄上清；(5)用含20mM?NaH₂PO₄，0.5M?NaCl，1％TritonX-100，pH7.4的裂解液重懸細菌沉淀，超聲波破碎，4℃，12000rpm離心20min，收集上清液；(6)加入終濃度為5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干擾，收集上清，利用攜帶His標簽的重組G5P蛋白與Ni⁺-NTA樹脂形成穩定的親和偶聯特性，使用Ni⁺-NTA瓊脂糖層析柱純化上清液中相對分子質量為9.5KD的重組G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鑒定。