本發(fā)明屬于臨床免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種腎小球基底膜抗體(GBM-Ab)定量測定試劑盒，包括磁分離試劑、酶標(biāo)記試劑、校準(zhǔn)品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩(wěn)定劑。本發(fā)明還公開了上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明還公開了上述試劑盒的檢測方法。本發(fā)明制備的試劑盒精確度、靈敏度以及穩(wěn)定性較好，并且成本低廉，操作簡單，應(yīng)用前景廣闊。

1.一種腎小球基底膜抗體定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括磁分離試劑、酶標(biāo)
記試劑、校準(zhǔn)品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩(wěn)定劑；
所述磁分離試劑的制備步驟如下：
一、磁微粒緩沖液配制過程，
1)、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris12.1g和NaCl8.5g加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆?br/>溶解；
2)、稱取BSA5g，量取新生牛血清50mL，Proclin3000.2mL至容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆?br/>解；
3)、調(diào)pH，控制pH在7.9-8.1之間；
4)、最后用純化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、磁分離試劑的制備過程
1)、取100mg含羧基活性基團(tuán)的磁微粒，直徑在0.5-2μm之間，然后添加0.025mol/L，pH4.5-5
的MES緩沖液10mL混懸；
2)、加入0.5-1mL濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min；
3)、磁分離，吸去上清，用0.025mol/L,pH4.5-5MES緩沖液10mL重懸；
4)、加入0.02-0.1mg的GBM抗原，室溫混懸120-240min；
5)、磁分離，吸去上清，用磁微粒緩沖液重懸至1mg/mL，完成磁分離試劑的制備；
所述酶標(biāo)記試劑的制備步驟如下：
一、酶標(biāo)記試劑稀釋液配制過程：
1)、量取800mL純化水于容器中，稱取Hepes6.06g、NaCl8.5g加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣?br/>全溶解；
2)、稱取BSA5g，ZnCl₂0.1g、Proclin-3000.2mL和MgCl₂0.1g于容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆?br/>溶解；
3)、調(diào)pH，控制pH在7.5-8.0范圍內(nèi)；
4)、最后用純化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、堿性磷酸酶與GBM抗體的偶聯(lián)：
1)、取1mgGBM抗體，加入10mg/mL的偶聯(lián)劑2-亞胺四氫噻吩溶液2-4μL，室溫靜置20min，
加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室溫靜置5min；隨后用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后
抗體，2-8℃保存?zhèn)溆茫?br/>2)、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20μL，室溫靜置30min，用G-25
凝膠柱除鹽，收集活化后的ALP，2-8℃保存?zhèn)溆茫?br/>3)、將上述活化的GBM抗體與活化的ALP混合，2-8℃條件下靜置12-24h，用Superdex200
凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得GBM抗體-ALP連接物濃溶液，2-8℃保存?zhèn)溆茫?br/>4)、將GBM抗體-ALP連接物濃溶液用酶標(biāo)記試劑稀釋液稀釋到0.02-0.1μg/mL，即得酶標(biāo)
記試劑；
所述校準(zhǔn)品的制備步驟如下：
一、校準(zhǔn)品稀釋液的配制：
1)、量取600mL純化水于容器中，稱取200mL新生牛血清加入容器中，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍?br/>2)、稱取磷酸氫二鉀3.4g、磷酸二氫鉀0.36g、Proclin3000.02mL加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣?br/>全溶解；
3)、調(diào)pH，控制pH在7.0-7.5之間；
4)、最后用純化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、校準(zhǔn)品的配制：用校準(zhǔn)品稀釋液將GBM抗體分別配制為0、5、20、50、150、300U/mL
共6個濃度點(diǎn)；
所述清洗濃縮液的制備步驟如下：
1)、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris12.1g和NaCl8.5g于容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆?br/>解；
2)、稱取Tween-205g、TritonX-1005g，充分?jǐn)嚢?，直至完全混勻?br/>3)、調(diào)pH，控制pH在7.5-8.0之間；
4)、最后定容1000mL，2-8℃保存；
所述底物溶液的制備步驟如下：
1)、稱取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na₂SO₃0.003g和Proclin-3000.4ml于1L燒杯中；
2)、用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍
在7.5－8.0之間；
3)、加入250mlLumi-Phos530后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；
所述穩(wěn)定劑的制備步驟如下：
1)、稱取乙二胺四乙酸二鈉2.3g和氯化鎂1.4g于1L燒杯中；
2)、用量筒量取900ml純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)pH，控制其范圍
在7.2－7.8之間；
3)、加入50ml甘油后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。