1.一種牛口蹄疫3ABC抗體化學發光檢測試劑盒,所述檢測試劑盒包含96孔化學發光免
疫分析板、酶標抗體、血清稀釋液、化學發光底物、化學發光增強劑和PBST洗滌液,其特征在
于:所述96孔化學發光免疫分析板包被3ABC融合蛋白,所述3ABC融合蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO:2所示;所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的兔抗牛lgG抗體;所述血清稀釋
液為pH=7.2~7.4且摩爾濃度為10mmol/L的磷酸鹽緩沖液,其中包含體積分數為 0.01% 的
Tween-20、質量體積百分數為1%的酪蛋白、體積分數為10%的馬血清和體積分數為1%的大腸
桿菌裂解液;所述化學發光底物為0.1mmol/L 的魯米諾溶液;所述化學發光增強劑包含
0.07 mmol/L的IPP、3mmol/L的H2O2和體積分數為0.002%的Tween-20;
所述3ABC融合蛋白的制備方法,包括以下步驟:
步驟一、利用基因定點突變技術,獲取突變后的3ABC基因,使其編碼的3ABC蛋白中3C蛋
白上的第46位組氨酸突變成酪氨酸和第163位半胱氨酸突變成甘氨酸;所述3ABC基因的核
苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
步驟二、將步驟一獲取的3ABC基因和載體 PproExHtB 均用限制性內切酶 BamHI與
XhoI雙酶切后進行連接,將突變后的全長3ABC基因插入線性化的重組表達質粒構建重組表
達質粒PproExhTB-mu3ABC,鑒定陽性后保存備用;
步驟三、將步驟二所得陽性重組表達質粒PproExhTB-mu3ABC轉化大腸桿菌Rosetta
(DE3),獲取重組大腸桿菌,將重組大腸桿菌接種到培養基上,待OD600=0.4-0.6時,向培養基
中加入IPTG,在16℃、220rpm條件下處理20h進行誘導表達,經離心、裂解,溶解包涵體,純化
蛋白,得3ABC融合蛋白。
2.如權利要求1所述的一種??谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒,其特征在于:所述
3ABC融合蛋白的包被濃度為250ng/mL。
3.如權利要求1所述的一種??谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒,其特征在于:所述
大腸桿菌裂解液是將未經轉化的大腸桿菌Rosetta(DE3)培養至對數期,離心,得菌體沉淀;
加入與菌體沉淀等體積的裂解緩沖液,混勻,得混合物;向混合物中加入其1/3體積的直徑
為0.22μm的玻璃珠,震蕩,離心,取上清,得大腸桿菌裂解液。
4.如權利要求3所述的一種牛口蹄疫3ABC抗體化學發光檢測試劑盒,其特征在于:所述
裂解緩沖液由以下成分組成:體積分數為2% 的Triton X-100;體積分數為1%的SDS;
100mmol/L的NaCl;10mmol/L,pH=8.0的Tris-HCl;1 mmol/L,pH=8.0的 EDTA;余量為水。
5.如權利要求1所述的一種牛口蹄疫3ABC抗體化學發光檢測試劑盒,其特征在于:所述
3ABC基因的獲取過程為:從感染口蹄疫病毒的牛的水皰液中提取總RNA,逆轉錄合成cDNA;
設計六組引物,以合成的cDNA為模板,首先利用引物3ABC-F 和3C-46-R 擴增第一段基因;
然后利用3C-46-F和3C-163-R擴增第二段基因;再用3C-163-F與3ABC-R擴增第三段基因;最
后通過融合PCR將擴增的三段基因融合成突變后的3ABC基因;
所述引物序列如下:
3ABC-F:5'-CGGGATCC ATCTCAATTCCTTCCCAAAAGTCC-3'
3ABC-R:5'-CCGCTCGAGT CTCATGGTGTGGTTCGGGGT-3'
3C-46-F:5'-CGTACCTCGTTACCTTTTCGC-3’
3C-46-R:5'-GCGAAAAGGTAACGAGGTACG-3’
3C-163-F:5'-AGGCTACGGTGGGGGAGC-3'
3C-163-R:5'-GCTCCCCCACCGTAGCCT-3'。
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