本發(fā)明涉及一種雙酚S檢測試劑盒及其制備和使用方法，屬于添加劑檢測技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括每個微孔內(nèi)包被濃度為0.5?2.5μg/mL雙酚S特異性抗原的酶標(biāo)板，濃度為0.5?2.5μg/mL的雙酚S特異性抗體工作液，且所述雙酚S特異性抗原與雙酚S特異性抗體的用量為1:1。本發(fā)明的試劑盒可以快速檢測在食品接觸制品中雙酚S的含量以及食品模擬物中雙酚S的遷移情況，也可以快速檢測飲料中雙酚S的污染水平，具有特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確且前處理簡單，對儀器設(shè)備要求低、檢測成本低的特點(diǎn)。

1.一種雙酚S檢測試劑盒，其特征在于，主要包括：
1)包被雙酚S特異性抗原的酶標(biāo)板：所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)雙酚S特異性抗原的濃度
為0.5-2.5μg/mL；
2)雙酚S特異性抗體工作液：該雙酚S特異性抗體的濃度為0.5-2.5μg/mL；
所述雙酚S特異性抗原與雙酚S特異性抗體的用量比為1:1；
所述雙酚S特異性抗原的制備方法為：
將1mmol雙酚S與10mmol碳酸鉀分散于80mL無水二甲基甲酰胺中，常溫?cái)嚢?0min，加入
10mmol的4-溴丁酸乙酯，加熱回流5h，使雙酚S的酚羥基被丁酸乙酯基所取代，得到中間產(chǎn)
物；隨后將中間產(chǎn)物加入過量三氟乙酸中，回流攪拌1h，脫去乙基的保護(hù)，裸露出羧基，制得
能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的雙酚S的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應(yīng)，與
牛血清白蛋白偶聯(lián)制備得到雙酚S特異性抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酚S檢測試劑盒，其特征在于，還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)
二抗是濃度按1:10000的比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙酚S檢測試劑盒，其特征在于，所述雙酚S特異性抗原為雙酚
S與載體蛋白的偶聯(lián)物，該雙酚S特異性抗原的濃度為2μg/mL；所述雙酚S特異性抗體為鼠源
單克隆抗體，該雙酚S特異性抗體的濃度為2μg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙酚S檢測試劑盒，其特征在于，還包括雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底
物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙酚S檢測試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋
白；所述雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、
1×10⁰μg/L、0.5μg/L；所述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫
或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述洗滌液為含有0.05％-0.5％吐
溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述封閉液為
含5％脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷
酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的雙酚S檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，主要包括以
下步驟：
1)制備雙酚S特異性抗原：
將雙酚S和碳酸鉀分散于二甲基甲酰胺中，加入4-溴丁酸乙酯，加熱回流，使雙酚S的酚
羥基被丁酸乙酯基所取代，得到中間產(chǎn)物；隨后將中間產(chǎn)物加入三氟乙酸中，回流反應(yīng)，脫
去乙基的保護(hù)，裸露出羧基，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的雙酚S的半抗原；再將其與N-羥基丁
二酰胺和碳二亞胺混合后反應(yīng)，與載體蛋白偶聯(lián)制備得到雙酚S特異性抗原；所述載體蛋白
為牛血清白蛋白；
2)包被酶標(biāo)板：
將上述雙酚S特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)雙酚S特異性抗原
的濃度為0.5-2.5μg/mL；
3)制備雙酚S特異性抗體：
以步驟1)中得到的雙酚S特異性抗原作為免疫原對小鼠進(jìn)行免疫；免疫后，取血清效價
高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)
胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完全佐劑腹腔注射
進(jìn)行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉
淀法進(jìn)行腹水純化，得到純化的雙酚S單克隆抗體；制備濃度為0.5-2.5μg/mL的雙酚S單克
隆抗體工作液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙酚S檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟1)中，制備雙
酚S特異性抗原的具體方法為：
將1mmol雙酚S與10mmol碳酸鉀分散于80mL無水二甲基甲酰胺中，常溫?cái)嚢?0min，加入
10mmol的4-溴丁酸乙酯，加熱回流5h，使雙酚S的酚羥基被丁酸乙酯基所取代，得到中間產(chǎn)
物；隨后將中間產(chǎn)物加入過量三氟乙酸中，回流攪拌1h，脫去乙基的保護(hù)，裸露出羧基，制得
能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的雙酚S的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應(yīng)，與
牛血清白蛋白偶聯(lián)制備得到雙酚S特異性抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙酚S檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟3)中，制備雙
酚S特異性抗體的具體方法為：
以步驟1)中得到的雙酚S特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，首
次免疫使用完全弗氏佐劑與雙酚S特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為0.45mg/mL，劑量為110
μg/只，以后每次加強(qiáng)免疫使用不完全弗氏佐劑與雙酚S特異性抗原溶液乳化，劑量同初次
免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強(qiáng)免疫一次，共免疫7-10次，當(dāng)抗體效價不再升高時，
進(jìn)行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐劑直接用雙酚S特異性抗原水溶液腹腔注射，劑量
同初次免疫；尾部取血檢測血清效價后，取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞
按6:1的比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完
全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并于一周前采用不完全佐劑腹腔注射
Balb/c小鼠進(jìn)行致敏，劑量為0.5mL/只；將細(xì)胞濃度為1.5萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射
到小鼠腹腔中，劑量為0.5mL/只；接種雜交瘤細(xì)胞7-10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次；存于
4℃冰箱保存；經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行腹水純化，得到純化的雙酚S單克隆抗體。
9.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的雙酚S檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，主要包括以
下步驟：
1)樣品前處理
準(zhǔn)確量取待測樣品，提取后定量吸取或萃取上清液，吹干后加入與水互溶的有機(jī)溶劑
復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液；
2)檢測
采用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有雙酚S特異性抗原的酶標(biāo)板
中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品檢測液，再加入雙酚S特異性抗體工作液，溫育后洗板，加入酶標(biāo)二抗
進(jìn)行酶活性的放大，再次洗板，加入底物顯色劑、終止液，然后以酶標(biāo)儀測定吸光度值；
3)結(jié)果分析
以抑制率I％為縱坐標(biāo)，以雙酚S濃度的對數(shù)lg[雙酚S]為橫坐標(biāo)，繪制雙酚S競爭抑制
曲線；將樣品的抑制率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對應(yīng)的濃度，乘以
其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中雙酚S的實(shí)際含量；
所述抑制率計(jì)算公式如下：
$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$
其中：I——抑制率
B——樣品溶液的平均吸光度值
B₀——0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
B_N——參比空白對照平均吸光度值。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的雙酚S檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟1)樣品前處理
中：
當(dāng)待測樣品為塑料制品，則定量稱取待測樣品，加入二氯甲烷超聲提取，隨后以甲醇萃
取，定量吸取甲醇，吹干后加入與水互溶的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測
液；
當(dāng)待測樣品為水基食品、酸性液體或酒精類液體，則定量稱取待測樣品，冷凍干燥后以
甲醇溶解，吹干后加入與水互溶的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液；
當(dāng)待測樣品為脂類液體，則定量稱取待測樣品，減壓干燥后以甲醇溶解，吹干后加入與
水互溶的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液；
當(dāng)待測樣品為果汁飲料，則定量稱取待測樣品，6000-9000r/min離心3-10min，取上清
液用乙酸調(diào)節(jié)pH值為3-5，再以固相萃取小柱萃取洗脫，收集洗脫液，吹干后加入與水互溶
的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液；
當(dāng)待測樣品為碳酸飲料，則定量稱取待測樣品，超聲脫氣，再以固相萃取小柱萃取洗
脫，收集洗脫液，吹干后加入與水互溶的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液。