1.建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯檢測試劑盒，主要由盒體，設在
盒體內的各種用液和酶標板組成，各種用液主要包括高效價抗血清、
標記抗體、陽性樣品和陰性樣品，各種緩沖液和顯色劑，其特征在于：
所述的高效價抗血清：選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund
氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜
脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、
1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，
析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉淀法結合DEAE離子
交換層析純化抗體，用2倍體積0.1M醋酸銨調節抗血清至pH4.8，
按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離
心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM?Tris-Cl?pH8.5緩沖液過夜，
透析除鹽，取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mM?Tris-HCl
pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M?NaCl的10mM
Tris-HCl?pH8.5緩沖液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮
透析，獲得純化的建蘭花葉病毒多克隆抗體；
所述的標記抗體：通過戊二醛二步法將堿性磷酸酶標記到純化抗
體，每1mg抗體加0.1％戊二醛0.05ml，靜置1小時，置于透析袋中
除去多余戊二醛，加入0.5mg堿性磷酸酶，混勻后置于4℃備用；
所述的陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒；濃度在0.1μg-100μ
g/ml范圍；
所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液；
所述的緩沖液包括：
包被緩沖液：20-80mmol/L?pH9.6碳酸鹽溶液；
封閉緩沖液：20-100mmol/L?pH7.4?PBS+1-5％脫脂奶粉；
洗滌緩沖液：50-200mmol/L?pH7.4?PBS+0.05-0.3％?Tween20；
底物緩沖液：5-20％?pH9.8二乙醇胺溶液；
終止液：1-5mol/L硫酸溶液；
所述的顯色劑為0.05-0.5mg/ml?pH9.8?PNP-Na溶液。
2.如權利要求1所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯檢測試劑盒
的制備方法，其特征在于：所述的制備方法主要包括下列制備過程：
1)、建蘭花葉病毒的提取和純化：取100g曼陀羅病葉加入100ml
0.5M檸檬酸緩沖液pH6.5勻漿后，加入100ml氯仿攪拌30分鐘，
在Beckman?JA-10離心機上10,000rpm離心20分鐘，取上清加入
4％PEG6000和0.3mol的NaCl，攪拌后靜置1小時，在Beckman?JA-10
離心機上10,000rpm離心20分鐘，棄上清，用pH6.5、0.5M檸檬酸
緩沖液充分溶解沉淀后重復一次PEG沉淀，第二次取沉淀后用5mM硼
酸緩沖液懸浮后，在Beckman?JA-10離心機上10,000rpm離心20分
鐘，取上清于超速離心機使用P42A轉頭40,000rpm離心2小時，
取沉淀用pH7.0、0.01M?PB重新懸浮，再進行一次差速離心，最后取
沉淀用適量pH7.0、0.01M?PB溶解，若雜質太多，再進行一次差速離
心，取粗提純病毒置于10％-40％蔗糖墊梯度，于超速離心機使用P42A
轉頭40,000rpm離心2小時，收集病毒條帶，再次于超速離心機使
用P42A轉頭40,000rpm離心2小時沉淀病毒，最后溶解于pH7.0、
0.01M?PB中，置于-40℃保存備用；
2)、抗血清的制備及純化：選用雄性白兔作免疫動物，加等量
Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射
和兩次靜脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、
1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最后一次注射后7-10天采血
2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉淀法結合DEAE
離子交換層析純化抗體，用2倍體積0.1?M醋酸銨調節抗血清至
pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm
離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM?Tris-Cl?pH8.5緩沖液過
夜，透析除鹽，取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mM
Tris-HCl?pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M?NaCl的
10mM?Tris-HCl?pH8.5緩沖液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，
濃縮透析，獲得純化的建蘭花葉病毒多克隆抗體；
3)、抗體標記：通過戊二醛二步法將堿性磷酸酶標記到純化抗體，
每1mg抗體加0.1％戊二醛0.05ml，靜置1小時，置于透析袋中除去
多余戊二醛，加入0.5mg堿性磷酸酶，混勻后置于4℃備用；
4)、陽性、陰性樣品的制備：
陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml
范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液；
5)、各種用液的制備：
包被緩沖液：20-80mmol/L?pH9.6碳酸鹽溶液；
封閉緩沖液：20-100mmol/L?pH7.4?PBS+1-5％脫脂奶粉；
洗滌緩沖液：50-200mmol/L?pH7.4?PBS+0.05-0.3％?Tween20；
底物緩沖液：5-20％?pH9.8二乙醇胺溶液；
終止液：1-5mol/L硫酸溶液；
顯色劑為0.05-0.5mg/ml?pH9.8?PNP-Na溶液。
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