本發(fā)明公開了一種檢測豬偽狂犬病毒抗體的試劑盒及阻斷ELISA檢測方法，包括辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬偽狂犬病毒單克隆抗體、豬偽狂犬病毒單克隆抗體是以豬偽狂犬病毒為免疫原得到的單克隆抗體、豬偽狂犬病毒為偽狂犬病毒鄂A株；試劑盒還包括酶標(biāo)板、樣品稀釋液、陰（陽）性對照、顯色液、洗滌液、終止液；其步驟：a、從試劑盒中取出預(yù)包被有病毒抗原的檢測板，將稀釋好的待檢血清加入抗原包被板中，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照孔；b、振勻孔中樣品，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗；c、每孔加酶標(biāo)單抗，洗滌，加顯色液，室溫避光顯色，加終止液，用酶標(biāo)儀測定每孔OD讀值。該方法特異性好，靈敏度高。檢測時(shí)間短；結(jié)果判定采用S/N比值法，準(zhǔn)確性高。

1.一種檢測豬偽狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：包括辣根過氧化物酶標(biāo)記
的豬偽狂犬病毒的單克隆抗體、豬偽狂犬病毒單克隆抗體是以豬偽狂犬病毒為免疫原得到的
單克隆抗體、豬偽狂犬病毒為偽狂犬病毒鄂A株；
所述的試劑盒還包括酶標(biāo)板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、顯色液A、顯色液B、
洗滌液、終止液；
所述的酶標(biāo)板是以豬偽狂犬病毒在包被酶標(biāo)板時(shí)用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氫鈉溶液作
為包被緩沖液；
所述的陽性對照為豬偽狂犬病毒免疫的高免血清；
所述的陰性對照血清為未感染過豬偽狂犬病毒的健康豬血清；
所述的洗滌液為含有0.05%Tween-20的PBS緩沖液；
所述終止液為含0.25%體積比氫氟酸溶液；
所述的顯色液A為含有50mg/mL過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B液為含有0.
2mg/mL?TMB?pH5.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液；
所述的樣品稀釋液液為含2.5mg/mL的明膠的DMEM培養(yǎng)基；
所述的酶標(biāo)板中包被抗原的制備方法為：
病毒培養(yǎng)及純化:BHK細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM于37℃培養(yǎng)，細(xì)胞長成單層
后，倒掉上清，接種50分之1原體積的病毒，加含3%體積比小牛血清的DMEM維持液，
液體剛蓋住細(xì)胞層即可，37℃吸附1小時(shí)后，添加維持液至原來培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的體積，37℃溫
箱繼續(xù)培養(yǎng)，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，將細(xì)胞瓶置-20℃冰箱中，反復(fù)凍融3次，收集
病毒液，收集的病毒液5000r/min4℃離心30min去沉淀，上清用27000r/min4℃離心1小
時(shí)，沉淀用2ml?pH7.20.01mol/L?PBS重懸，以PBS制備20%、35%、45%和60%的不連
續(xù)梯度蔗糖，加樣品至梯度界面上，4℃27000r/min離心90min，收集45%濃度處的蛋白帶
至離心管中，用30ml?PBS稀釋重懸，27000r/min離心2小時(shí)脫糖，最后用2ml?PBS懸浮
沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>2.權(quán)利要求1所述的一種檢測豬偽狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒非診斷性檢測方法，其
步驟是：
1）從試劑盒中取出預(yù)包被有病毒抗原的檢測板，將稀釋好的待檢血清1：1稀釋100
μL加入抗原包被板中，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照孔，各設(shè)2孔，每孔100μL；
2）輕輕振勻孔中樣品，置37℃溫育30分鐘，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板5次，
200μL/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次在吸水紙上拍干；
3）每孔加酶標(biāo)單抗100μL，置37℃溫育30分鐘，洗滌5次,方法同步驟2），每孔加
顯色液A、顯色液B各一滴50μL，混勻，室溫避光顯色10分鐘，每孔加終止液一滴50μL，
15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測定每孔OD_630nm讀值。