本發(fā)明公開(kāi)了一種孔雀石綠的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及試劑盒。本發(fā)明首次針對(duì)孔雀石綠探討了其化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫機(jī)理，成功建立了孔雀石綠的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系和檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了高靈敏性和高特異性的完美結(jié)合。所述試劑盒具有高靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度與穩(wěn)定性；簡(jiǎn)化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，非常適用于孔雀石綠殘留的痕量分析與批量檢測(cè)，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

1.一種孔雀石綠的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：?(1)待測(cè)樣品前處理；?(2)將孔雀石綠包被抗原包被于發(fā)光固相載體，分別加入標(biāo)樣或經(jīng)前處理后的待測(cè)樣品，再分別加入抗孔雀石綠抗體反應(yīng)；所述包被抗原為孔雀石綠半抗原NH2-LMG與載體蛋白偶聯(lián)形成的完全抗原；?(3)經(jīng)步驟(2)反應(yīng)后分別加入酶標(biāo)記物進(jìn)行反應(yīng)，再加入發(fā)光底物進(jìn)行發(fā)光并測(cè)定待測(cè)樣品的發(fā)光值；所述發(fā)光底物液為將2.0mg魯米諾、0.8mg對(duì)碘苯酚溶于10mL的pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液得到；?(4)以步驟(3)測(cè)定的發(fā)光值的平均值計(jì)算待檢樣品的抑制率，根據(jù)孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的抑制率，計(jì)算出待測(cè)樣品中孔雀石綠的濃度；?其中，步驟(1)所述待測(cè)樣品為組織樣，所述組織樣的前處理包括以下步驟：?(a)提取組織樣；將組織樣搗碎，加入提取液，高速勻漿10秒鐘；所述提取采用的提取液按照以下配比配制：10mL0.36mol/L鹽酸羥胺溶液、15mL1.0mol/L對(duì)甲苯磺酸溶液和25mL0.05mol/L乙酸胺組成；?(b)往步驟(a)體系中加入乙腈，震蕩提取后離心處理，分別收集上清液和殘?jiān)?(c)步驟(b)所得殘?jiān)屑尤胍译?，震蕩提取后離心處理，收集上清液；?(d)合并步驟(b)和步驟(c)所得上清液，加入二氯甲烷，劇烈震蕩后靜置分層，收集二氯甲烷層；重復(fù)加入二氯甲烷，震蕩、分層，收集二氯甲烷層，將二氯甲烷合并真空旋干，用乙腈復(fù)溶得復(fù)溶液；?(e)取步驟(d)所得復(fù)溶液加入PBS緩沖溶液混勻，所述PBS緩沖液為將0.4gKH₂PO₄、5.8gNa₂HPO₄·12H₂O、16gNaCl和0.4gKCl，加蒸餾水定容至2000mL配置成的pH值為7.4的PBS緩沖液，即得到待測(cè)樣品。?2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法的孔雀石綠化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫的試劑盒，其特征在于包括盒體、發(fā)光板，還包括抗孔雀石綠抗體溶液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體溶液、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液、發(fā)光底物液和底物緩沖液、組織樣提取液、洗液；所述發(fā)光板為微孔板，孔內(nèi)包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結(jié)合的包被抗原；?所述發(fā)光底物液為將2.0mg魯米諾、0.8mg對(duì)碘苯酚溶于10mL的pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液得到；?所述底物緩沖液為將20μL體積比濃度為30％的過(guò)氧化氫溶于10mL的pH值為7.0的Tris-HCl緩沖液得到；?所述發(fā)光板為96孔或40孔，孔內(nèi)包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結(jié)合的包被抗原，并封閉微孔表面未吸附位點(diǎn)；所述封閉采用重量體積比為1.0～5.0％的脫脂奶粉水溶液為封閉液；?所述洗液為將0.4gKH₂PO₄、5.8gNa₂HPO₄·12H₂O、16gNaCl、0.4gKCl、1mLTween-20，加蒸餾水定容至2000mL配置成的pH值為7.4的PBST磷酸鹽緩沖液；?所述孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液為取孔雀石綠標(biāo)樣5.0mg，溶于50mL乙腈中，配制成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；?所述孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液為6個(gè)梯度濃度的孔雀石綠溶液，濃度依次為0ng/mL，0.02ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，2.5ng/mL，12.5ng/mL，通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液用PBS緩沖液稀釋獲得；所述PBS緩沖液為將0.4gKH₂PO₄、5.8gNa₂HPO₄·12H₂O、16gNaCl和0.4gKCl，加蒸餾水定容至2000mL配置成的pH值為7.4的PBS緩沖液。?3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述發(fā)光板為聚苯乙烯微孔板。?4.一種權(quán)利要求2所述的試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟：?(1)做標(biāo)準(zhǔn)和樣品的平行檢測(cè)：在發(fā)光板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔中加入待測(cè)樣品，然后每孔中分別加入抗孔雀石綠抗體溶液，輕拍混勻，室溫震蕩孵育；?(2)倒出步驟(1)發(fā)光板孔內(nèi)中的液體，并用洗液清洗干凈發(fā)光板孔；?(3)往經(jīng)步驟(2)處理后的孔中加入酶標(biāo)記物溶液，輕拍混勻，避光室溫孵育；?(4)倒出發(fā)光板孔內(nèi)中的液體，并用洗液清洗干凈發(fā)光板孔；?(5)每孔加入底物緩沖液與發(fā)光底物液的等體積混合液，輕拍混勻，在波長(zhǎng)425nm下，測(cè)定各孔發(fā)光值，在加入發(fā)光液后5min內(nèi)讀取吸光值；?(6)以所獲樣品發(fā)光值的平均值計(jì)算抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，孔雀石綠濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程，根據(jù)方程式求出對(duì)應(yīng)樣品的孔雀石綠濃度。?