本發明涉及一種檢測禽流感病毒的熒光抗體的制備方法及固相免疫熒光檢測試劑盒。本發明采用別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標記抗禽流感病毒抗體制備熒光抗體，分別用化學交聯劑SPDP將APC、抗體衍生，衍生物以適宜摩爾比液相交聯，然后經高壓液相色譜純化制備熒光抗體。熒光抗體與CNBr活化的瓊脂糖微球、抗禽流感病毒抗體、洗滌液等組裝成固相免疫熒光檢測試劑盒。試劑盒使用方法為：微球載體活化后先用抗禽流感病毒抗體包被，洗滌，包被抗體的微球與待測樣品(抗原)結合，洗滌后與熒光抗體結合，洗滌去除未結合的熒光抗體，熒光顯微鏡下觀察、判定結果。本發明制備的熒光抗體交聯效率高、純度高、紅色熒光明亮、熒光抗體性質穩定。試劑盒采用的微球固相載體能顯著提高熒光檢測靈敏度，適于禽流感病毒的快速檢測。

1.一種檢測禽流感病毒的熒光抗體的制備方法，包括：陰離子交換層析法純化別藻藍蛋
白APC，分別用摩爾比20-50：1、50-100：1的化學交聯劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫)
丙酸酯SPDP將APC、抗禽流感病毒抗體衍生，二硫蘇糖醇DTT以50-100：1的摩爾比還原
抗體衍生物產生抗體-HS，抗體-HS與APC衍生物以摩爾比1：1-3液相交聯，經高效液相
色譜HPLC純化制備APC標記的抗禽流感病毒熒光抗體，其中APC由鈍頂螺旋藻Spirulina?
platensis陰離子交換層析制備，制備步驟為：藻體細胞加入5倍體積v／w的20mM?pH6.8-7.0
磷酸緩沖液，反復凍融3次，離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60％w／v，4℃冰箱放置
24h，離心，沉淀溶于20mM?pH7的磷酸緩沖液中，20mM?pH7的磷酸緩沖液透析，透析液陰
離子交換色譜柱層析純化，離子交換柱經20mM?pH5.0含50mM?NaCl醋酸緩沖液預平衡，洗
脫液為20mM?pH3.6含50mM?NaCl醋酸緩沖液，收集天藍色洗脫液即為純化的螺旋藻別藻藍
蛋白，純化的APC硫酸銨沉淀4℃避光保存，使用前用50mM?pH7.5PBS充分透析除鹽，調
整濃度為5-10mg／mL。
2.一種檢測禽流感病毒的固相免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于包括：權利要求1制備
的APC標記抗禽流感病毒熒光抗體、瓊脂糖微球載體、抗禽流感病毒多克隆抗體、稀鹽酸溶
液、PBS，可用于禽流感病毒的快速免疫熒光檢測。
3.根據權利要求2所述的一種檢測禽流感病毒的固相免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于
試劑盒的使用方法為：取1mL活化凝膠立即與2mL濃度為5mg／ml的抗禽流感病毒多克隆
抗體混勻，20℃緩慢振蕩作用12h，加入2mL0.1M的乙醇胺封閉，20℃緩慢振蕩作用4h，
離心去上清，用50mM?pH8PBS反復沖洗凝膠，離心獲得偶聯有抗體的瓊脂糖凝膠，用100
mM?pH7.5的PBS配成10％v／v的懸浮液，取偶聯有抗體的瓊脂糖凝膠50uL，置于潔凈的試
管中，加待檢病毒液100uL，37℃溫育2h，用100mM?pH7.5的PBS沖洗10次，加入5ug／ml
濃度的熒光標記抗體100uL，37℃溫育2h，用100mM?pH7.5的PBS沖洗5次，吸取少量
微球，滴于低熒光背景的玻片上，蓋片，甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下以紅光激發，觀察、
判定結果，陽性微球在紅光激發下發射明亮的紅色熒光，陰性微球無熒光。