本發(fā)明涉及一種基于納米免疫磁珠?近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)檢測(cè)試劑盒。本試劑盒中，以近紅外熒光染料標(biāo)記靶向于LAM的單克隆抗體，靶向于LAM的多克隆抗體包被在納米磁珠表面。采用雙抗體夾心法原理，磁性分離結(jié)合物和游離物，采用便攜式高靈敏度低噪聲激發(fā)式熒光檢測(cè)儀檢測(cè)磁性結(jié)合物的熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)待檢樣品中LAM含量。本發(fā)明適用于臨床病理標(biāo)本中的LAM檢測(cè)，具有快速、靈敏、抗雜散熒光干擾、發(fā)射熒光保存時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。

1.一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌LAM檢測(cè)試劑盒，其特征
在于：所述試劑盒由近紅外熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體、多克隆抗體包被的納米磁珠、磁性
分離器、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液組成；其中，近紅外熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體為兔抗LAM；包
被納米磁珠的多克隆抗體為兔多抗LAM；建立LAM標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度和熒光發(fā)射值之間的工作
曲線，將所測(cè)得的發(fā)射熒光強(qiáng)度，代入方程即可完成樣品中目標(biāo)多糖含量的定量檢測(cè)；
所述基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌LAM檢測(cè)試劑盒的制備方
法，步驟如下：
(1)制備近紅外熒光染料標(biāo)記的LAM單克隆抗體；
將購(gòu)自Thermofisher公司的Dylight800用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋10倍，取1.4μL
與購(gòu)自Mossman Associates Inc公司的濃度為1mg/ml、20μg兔抗LAM單克隆抗體輕柔混合
均勻后于室溫避光反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記產(chǎn)物放入透析袋中，4℃，PBS緩沖液透析
4小時(shí)；標(biāo)記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5％BSA和0.1％Tween20，疊氮化鈉0.1‰，4℃
保存；使用前將標(biāo)記產(chǎn)物以PBS稀釋2000倍；
(2)LAM多克隆抗體的制備
1)LAM的提純：
將MTB H37RV接種在羅氏雞蛋培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，
100℃水浴滅活2小時(shí)，用2ml的pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌2次，8000r/min、10min離心棄上
清；加入2ml氯仿∶甲醇＝2∶1混合液脫脂3次，8000r/min，10min離心棄上清；加入2ml的pH值
為7.4的PBS懸浮，冰浴超聲破碎：超聲10s，停10s，共30min，8000r/min，10min，離心取上清，
加入2ml40％的苯酚萃取，70℃，1小時(shí)，8000r/min，10min離心取上清，用蒸餾水透析2天，采
用SepHacryl S-100凝膠柱層析，用0.05mmol/L的NaCl溶液洗脫，流速0.5ml/min，用EP管收
集2ml/管；
2)LAM的定量：
取濃硫酸1ml，9％苯酚200μl，標(biāo)本200μl，混勻后避光反應(yīng)30分鐘，空白調(diào)零，以L-阿拉
伯糖為多糖標(biāo)準(zhǔn)，制作濃度范圍0.1～3.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)吸光度A₄₈₅值，直線回歸計(jì)算
標(biāo)本中多糖含量；
3)LAM多克隆抗體制備：
以本實(shí)驗(yàn)室制備的LAM為免疫原，委托江南大學(xué)食品學(xué)院代為制備LAM多克隆抗體，制
成后的抗體為兔抗LAM多克隆抗體，濃度為1mg/ml；
(3)制備LAM多克隆抗體包被的納米磁珠，購(gòu)自武漢哇哇噻納技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司北京生
物技術(shù)研究所；
1)納米磁珠的預(yù)處理：
輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01ml的25mg/ml懸浮液加入1.5ml EP試管中；再加入
0.1ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復(fù)上述步驟1次；
加入1ml 0.1M、pH為5.0的乙磺酸溶液，重懸磁珠；
2)納米磁珠的活化
將上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗滌2次，棄上清；
臨用前配置終濃度為0.1M的MES，其內(nèi)含EDC和NHS的濃度均為40g/L，加入上述兩種物
質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用，用該液重懸磁珠；
用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清；
3)磁珠與蛋白的鏈接；
在已處理好的磁珠中加入50μL的濃度為1mg/ml的LAM多克隆抗體和pH值為5.5的500μL
PBS，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小時(shí)；
用pH5.5，0.05％Tween的PBS緩沖液清洗3次，棄上清；
加入1ml，0.1M，0.1％BSA Tris緩沖液，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小時(shí)；
加入1ml，pH5.5，0.05％Tween的PBS緩沖液，靜置2分鐘，棄上清；重復(fù)3次，加入1ml的pH＝
5.5的PBS緩沖液，棄上清，重復(fù)3次；棄上清時(shí)，試管需置于磁板上；
加入1ml，pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05％NaN₃的PBS緩沖液，待用；
(4)制備LAM系列標(biāo)準(zhǔn)品；
LAM，pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至1、5、25、125、625ng/ml。