一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒制備方法，試劑盒包括：甘膽酸R1試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；甘膽酸R1試劑是將甘膽酸?蛋白偶聯物與緩沖液充分混合得到，甘膽酸R2試劑是由甘膽酸?蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合得到，甘膽酸校準品是由人源性甘膽酸和緩沖液組成，該方法是將含有甘膽酸的人血漿、血清樣本與甘膽酸?蛋白偶聯物競爭結合甘膽酸?蛋白抗體膠乳顆粒，與甘膽酸結合的甘膽酸?蛋白抗體膠乳顆粒不產生濁度，而與甘膽酸?蛋白偶聯物結合甘膽酸?蛋白抗體膠乳顆粒會產生濁度變化，通過測定反應后體系濁度的降低程度來對甘膽酸進行定量分析。本發明極大地提高了免疫反應的信號強度，使低含量物質在免疫結合時也能產生較強的濁度反應，以供檢測。

1.一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
一、甘膽酸-蛋白偶聯物的制備：
1)準確稱取2mg甘膽酸，將其溶解在100μl DMF試劑中，所得溶液為A液；用DMF配制
89.4mg/mL的NHS溶液，所得溶液為B液；用DMF配制60.2mg/mL的二環己基碳二亞胺溶液，所
得溶液為C液；稱取16mg血藍蛋白，將其溶解在1mL pH7.2、濃度0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中；
所得溶液為D液；
2)分別取B液和C液各30.7μL加到100μl A液中，室溫下攪拌90min；
3)將攪拌完畢的混合液加到D液中，在4℃條件下攪拌12h；
4)將步驟3)處理的反應液放入pH7.4、濃度0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中透析12h，即得到
甘膽酸-蛋白偶聯物；
二、甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒制備:
1)以步驟一所得的甘膽酸-蛋白偶聯物皮下免疫小鼠；選擇免疫后血清效價大于10000
的小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過BSA-CG板篩選得到甘膽酸單克隆細胞
抗體；
2)把1.5g膠乳顆粒加入150mlpH5.5、濃度80mmol/L的2-嗎啉代乙磺酸緩沖液中，攪拌
30分鐘；然后添加0.067mg/ml的碳化二亞胺20ml以及0.033mg/ml的N羥基琥珀酰亞胺20ml，
常溫反應45分鐘；
3)把經步驟2)反應后的混合物，以15000轉/min離心15分鐘，去上清液，然后用150ml
pH 8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得到膠乳顆粒混懸液；
4)將所得的膠乳顆粒混懸液重復步驟3)，重復后所得到的膠乳顆?；鞈乙哼M行清洗；
清洗后，用濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調整至700ml；
5)將180mg甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300ml pH8.2、0.1mol/L磷酸緩沖液中，攪拌
均勻；加入到步驟4)的膠乳溶液中；然后置于37度的搖床中，反應2-4個小時；再加入0.5g/
ml甘氨酸10ml，再次反應30分鐘；
6)步驟5)反應結束后，將5g牛血清白蛋白加到上述混合液中，攪拌均勻后，室溫放置
12h；然后9000轉/min離心15分鐘，去上清液，用500ml pH 8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖
液重懸；得膠乳顆?；鞈乙海?br/>7)將所得到的膠乳顆?；鞈乙涸俳?000轉/min離心15分鐘，去上清液，用500ml pH
8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；將再次重懸后所得的膠乳顆?；鞈乙河胮H 8.2、
濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調整至1000ml；所得溶液即為甘膽酸-蛋白抗體包被
的膠乳顆粒；
三、甘膽酸R1試劑的制備
將步驟一制備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯物與緩沖液充分混合即得甘膽酸R1試劑，所述
緩沖液為濃度10-100mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8；所述緩沖液中含有濃度
2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、
0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯物的濃度
為0.05-2mg/mL；
四、甘膽酸R2試劑的制備
將步驟二制備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合即得甘膽酸
R2試劑，所述懸浮緩沖液為含有穩定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-Na0H緩沖液；
所述穩定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50mM的乙二
胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-
0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質量濃度為0.05-1.0％；
五、甘膽酸校準品的制備
向緩沖液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml
的一組校準品；所述緩沖液為濃度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.1-
1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉。