本發明公開了一種檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物及試劑盒，屬于微生物檢測技術領域。本發明提供的引物序列如SEQ ID:1?4所示，通過在NCBI的嗜水氣單胞菌ATCC7966株基因序列庫中檢索氨基糖苷類耐藥基因序列并設計特異性引物，能夠對嗜水氣單胞菌aac(6’)?Iz、aph等氨基糖苷類耐藥基因進行快速檢測。本發明還公開了包含上述引物的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的試劑盒，能在實驗室內快速、準確地檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類抗生素相關耐藥基因。

1.檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物組合物，其特征在于，包括如下引物
對：
(1)擴增aac(6’)-Iz耐藥基因的引物對，其核苷酸序列為
F1：5’-CCCATCTCAACGCCTTTC-3'(SEQ ID NO:1)；
R1：5’-AAGAAGACGACCCGCTCC-3'(SEQ ID NO:2)；
和
(2)擴增aph耐藥基因的引物對，其核苷酸序列為
F2：5’-GCGATTCCCTCTTGTTG-3'(SEQ ID NO:3)；
R2：5’-GCAGGCGAAGGTCTCA-3'(SEQ ID NO:4)；上述2對引物對在一次檢測中共同使用。
2.權利要求1所述的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物組合物在制備檢測
嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的試劑中的應用。
3.一種嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒，其特征在于，所述是試劑盒包
含如權利要求1所述的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的引物組合物。
4.根據權利要求3所述的一種嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒，其特征
在于，該試劑盒還包括如下試劑：
(1)PCR反應液：該PCR反應液中含有DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、Mg²⁺、dNTP；
(2)陽性對照：分別含有aac(6’)-Iz、aph耐藥基因的嗜水氣單胞菌基因組DNA的水溶
液；
(3)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA的水溶液；
所述引物組合物中的引物以ddH₂O溶解，每種引物的濃度為2.5μM。
5.根據權利要求4所述的嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒，其特征在于，
所述陰性對照還包含殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌基因組
DNA的水溶液。
6.根據權利要求4所述的嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒，其特征在于，
陽性對照中含耐藥基因的嗜水氣單胞菌基因組DNA濃度為10ng/μL，陰性對照中大腸桿菌基
因組DNA的濃度為20ng/μL。
7.根據權利要求3-6任一項所述的嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測試劑盒在非
診斷和治療目的的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因中的應用。
8.一種非診斷和治療目的的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥性的方法，將樣品進行
PCR擴增，以權利要求1所述的引物組合物對樣品進行擴增，所得PCR樣品進行檢測，具有擴
增結果的即為樣品具有耐藥性，否則對氨基糖苷類敏感。
9.一種非診斷和治療目的的檢測嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥性的方法，將樣品進行
PCR擴增，包括如下步驟：
(a)PCR反應液的制備：從-20℃冰箱中取出試劑盒的各組分，室溫融化，放冰盒上備用；
加樣前10分鐘內，按檢測樣本數(n)配置PCR反應液XμL；
(b)X＝(9μL PCR反應液+4μL引物組合物混合液+5μL ddH₂O)×(樣本數n+1份陽性對照+
1份陰性對照+1份空白對照)；
振蕩混勻后，3000rpm離心10s，按每份18uL分裝到0.2mL PCR反應管中備用；
(c)加樣：向分裝好試劑的反應管中，分別加入細菌樣本DNA模板2μL，陽性對照孔加入2
μL陽性對照品，陰性對照孔加入2μL陰性對照品，空白對照孔加入2μLddH₂O，加樣過程要求
冰上操作，3000rpm離心10s，放入PCR儀進樣槽；
(d)PCR擴增：進行嗜水氣單胞菌氨基糖苷類耐藥基因檢測，反應條件如下：94℃預變性
3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環；72℃10min；4℃10min；反應體積設為20μL，設
定后運行；
(e)凝膠電泳檢測：采用常規方法制備1.2％瓊脂糖凝膠后放入加有TAE緩沖液的電泳
槽中待用；將PCR樣品取出后加入3μL上樣緩沖液后混勻，取5μL樣品加入膠孔中于90V電壓
下電泳30min，電泳完成后取出凝膠置于凝膠成像儀中拍照并記錄結果；結果中具有條帶說
明樣品對氨基糖苷類藥物耐藥，不具有條帶則表明對氨基糖苷類藥物敏感；
所述引物組合物如權利要求1所示。